Визначені антиоксидантні і мембраностабілізуючі властивості екстракту буркуну при експериментальному токсичному гепатиті, що дозволить рекомендувати його для комбінованої терапії при зниженні функціональної активності печінки.
Виявлене збільшення детоксикаційної функції печінки та функціональної стійкості еритроцитів у старих тварин надає можливість застосовувати препарат при прискореному старінні, для підвищення резистентності організму до несприятливих впливів зовнішнього середовища.
Отримані дані про механізм дії екстракту буркуну за результатами біологічних методів дослідження впроваджено в практичні заняття кафедри фізіології людини і тварин біологічного факультету ОНУ ім. І.І. Мечнікова.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто були здійснені патентно-інформаційний пошук та аналіз наукової літератури за темою дисертації. Визначена мета і задачі дослідження, методичні підходи, опрацьовані моделі, за якими особисто виконані експериментальні дослідження. Здійснена статистична обробка отриманих результатів і оформлення їх у вигляді таблиць та графиків, аналіз і узагальнення результатів, сформульовано висновки, опубліковані основні матеріали дисертації.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені і знайшли позитивну оцінку на IV українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології: “Актуальні питання фармакології” (Вінниця, 2004); XII Російському Національному конгресі “Человек и лекарство” (Москва, 2005); IV національному конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ, 2005); XI з’їзді офтальмологів України (Одеса, 2006); сімпозіумі “Рослинні поліфеноли та неспецифічна резистентність” (Одеса, 2006); III національному з’їзді фармакологів України “Фармакологія 2006 – крок у майбутнє” (Одеса, 2006); І-ої науково-практичній конференції „Безопасность лекарств: от разработки до медицинского применения” (Київ, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 20 наукових робіт, з яких 9 статей у наукових журналах, рекомендованих ВАК України, 1 патент України, 10 тез доповідей на наукових форумах різних рівнів.
Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 170 сторінках, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 6 розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел із 342 найменувань (284 вітчизняних і країн СНД та 58 іноземних). Робота ілюстрована 30 таблицями і 21 рисунком.
Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили в лабораторії фармакології і тканинної терапії (ІОХіТТ) ім. В.П. Філатова АМН України, яка сертифікована ДФЦ МОЗ України (посвідчення № 31 від 2006 р.) у повній відповідності з вимогами Комісії з біоетики ІОХіТТ (протокол № 8 від 7.11.2006 р.) та Методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Київ, 2001).
Роботу виконано на 159 кролях породи Шиншила масою 1,8– 6,0 кг (різного віку), 120 білих щурах лінії Wistar масою 180–220 г, 94 нелінійних білих мишах масою 20–22 г, 35 жабах, вирощених у розплідниках віваріїв Одеського державного медичного університету та ІОХіТТ. Всі тварини були статевозрілі, обох статей, знаходились в умовах віварію ІОХіТТ на стандартному раціоні за встановленими нормами.
Водний екстракт буркуну для ін'єкцій виготовлено з трави буркуну лікарського в лабораторії фармакології і тканинної терапії ІОХіТТ за методом академіка В.П. Філатова, технологію запатентовано (Патент України на корисну модель № 3544 „Спосіб одержання водного екстракту буркуну” від 15.11.04 р.).
В якості референтного препарату використовували тканинний препарат ФіБС, який відноситься до фармакотерапевтичної групи біогенних стимуляторів, що регулюють метаболичні процеси (М.Д. Машковский, 2005).
Визначення в екстракті буркуну кумарину і двох оксікумаринів (скополетин, умбеліферон) проводилося після екстракції їх із препарату хлороформом з наступною хроматографією на пластинках Сорбфіл у суміші розчинників циклогексан Р – ацетон Р – 2–пропанол Р (20:4:1). Наявність кумаринів встановлювалася в УФ світлі при довжині хвилі 366 нм після обробки лужним розчином (ДФУ, 2001). Кількісне визначення суми кумаринів і дослідження спектрів поглинання проводилося на спектрофотометрі СФ–46 у кюветі з товщиною шару 1 см при довжинах хвиль 240–360 нм.
Гостру та субхронічну токсичність вивчали на 3-х видах лабораторних тварин (миші, щури, кролі) згідно Методичним рекомендаціям ДФЦ України (2001). Використовувалися дози з урахуванням максимально припустимих фізичних обсягів введення рідин (К.К. Сидоров, 1973). Для патоморфологічних досліджень тканини міокарда, легень, печінки, нирок були фіксовані в 10 % розчині нейтрального формаліну, піддавалися спиртовій проводці, заливці в парафін. Оглядові препарати фарбувалися гематоксилін-еозином (Г.А. Меркулов, 1969). Ультратонкі зрізи тканини печінки фарбували розчинами уранілацетату і цитрату свинцю. Переглядали і фотографували зразки в електронному мікроскопі ПЭМ–100.
Експериментальні дослідження рівня біологічної активності екстракту буркуну на скринінгових біотестах (дріжджовому, парабіотичному, стрихніновому, антигіпоксичному) виконані відповідно Методичним рекомендаціям ДФЦ України (2001).
Вплив екстракту буркуну і ФіБСу на детоксикуючу функцію печінки оцінювали на моделі гексеналового сну у кролів. Гексенал вводили внутрішньовенно в дозі 35 мг/кг маси у вигляді 5 % водного розчину. Тривалість сну в контрольній групі приймали за 100 %.
Гепатозахисну дію екстракту буркуну і ФіБСу вивчали в умовах токсичного ураження печінки тетрахлорметаном (CCl4), який вводили внутрішньошлунково у вигляді 50 % олійного розчину з розрахунку 0,5 мл на 100 г маси тіла протягом двох днів (Ю.И. Губский, 1989).
Для оцінки профілактично-лікувальної дії екстракту буркуну і ФіБСу на хід експериментального токсичного ураження печінки вивчали активність маркерних ферментів цитолізу: аланінамінотрансферази (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ) – за Райтман і Френкель у модифікації В.Г. Колб і В.С. Камишніков (1986), кількість загального білка в сироватці крові – біуретовим методом (А.М. Горячковский, 1998). Антиоксидантну дію препаратів визначали за вмістом дієнових кон’югатів (ДК) (В.А. Костюк та ін., 1984) і малонового діальдегіда (МДА) у сироватці крові (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977).
Антитоксичні та мембраностабілізуючі властивості екстракту буркуну вивчали у кролів різного віку, масою від 3,6–6,0 кг, при 30-денному курсовому введенні. Для оцінки антитоксичної функції печінки використовували бромсульфалеїнову пробу за методикою В.В. Меньшикова (1971), осмотичну за М.А. Базарновою (1982) і перекисну резистентність еритроцитів (М. Mino, 1978). Визначали вміст водо- і жиророзчинних антиоксидантів в крові (J. Glavind, 1963) і активність каталази (М.А. Королюк та ін., 1988) в плазмі крові та печінці.
Вивчення впливу екстракту буркунуі ФіБСу на коагуляційний гемостаз при курсовому введеннібуло проведено на 51 кролі породи Шиншила, масою 3,0–4,7 кг, розподілених на 9 піддослідних груп: 3 контрольних (по 5 кролів) і 6 піддослідних (по 5–7 кролів). Показники гемостазу у тварин вивчали до початку досліду (вихідний рівень), на 7, 14, 21 дні введення, через 1 і 2 тижні після закінчення курсу. Екстракт буркуну і ФіБС вводили тваринам підшкірно в дозах: 0,3; 1,0і 3,0 мл/кг для кожної піддослідної групи, відповідно. Контрольним тваринам вводився фізіологічний розчин в аналогічних об’ємах. Визначали наступні показники коагулограми: тромбіновий, протромбіновий, активований парціальний тромбопластиновий час і вміст фібриногену оптичним методом на турбідиметрічному гемокоагулометрі фірми "Солар" (Мінськ) з використанням реактивів фірми "НПО Ренам" (Москва) згідно стандартним методикам (З.С. Баркаган, А.П. Момот, 2001) з урахуванням методичних рекомендацій до приладу (В.В. Дмитриев, 1997). Хагеман-залежний фібриноліз визначали за Kowalski, Kopec, час лізису еуглобулінового зсідка за Kowarzyk, Buluk(З.С. Баркаган, А.П. Момот, 2001) та показник фібринолітичної активності згідно методичним рекомендаціям (Ю.О. Киселевский и др., 1997).
Вплив екстракту буркуну на перебіг експериментальної гіфеми – крововиливу у передню камеру ока (Г.В. Самсонов та ін., 1985) проводили на кролях породи Шиншила, статевозрілих, масою 3,6–5 кг. Усього використано 15 кролів (30 очей), розподілених нарівно на 3 групи: 1 група –контрольна патологія (без лікування); 2 і 3 групи –модель гіфеми з наступним введенням екстракту підкон’юнктивально і підшкірно, відповідно. Екстракт буркуну вводився через 4 години після створення гіфеми в дозі 0,3 мл/кг протягом 10 днів.
Оцінку коагуляційної і фібринолітичної активності слізної рідини проводили за Е.Г. Сомовим, В.В. Бржеским (1992). Внутрішньоочний тиск вимірювали за допомогою тонометра Маклакова масою 7,5 г у ті ж терміни.
Статистичну обробку даних проводили з використанням методів параметричної і непараметричної статистики за допомогою програми ”MicrosoftExcel для Windows – 2000, Statistica5.5 (С. Гланс, 1999).