Люминесцентная микроскопия основана на свойстве многих веществ давать свечение — люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра света. Ряд биологических веществ, таких как простые белки, коферменты, некоторые витамины, лекарственные средства (ЛС) обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться при добавлении к ним специальных красителей — флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно, но могут избирательно окрашивать отдельные клеточные структуры или определённые химические соединения. На этом основано использование люминесцентной микроскопии в цитологических и гистохимических исследованиях. Иммунофлюоресценция в люминесцентном микроскопе позволяет выявлять различные Аг и их концентрацию в клетках, при этом возможна идентификация вирусов, определение AT и иммунных комплексов, гормонов, различных продуктов метаболизма и др.Люминесцентную микроскопию применяют для диагностики вирусных инфекций, с помощью вторичной люминесценции диагностируют злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, определяют очаги ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т. д.
Ультрафиолетовая и инфракрасная микроскопия основана на способности поглощения УФ- и инфракрасных лучей определённых длин волн некоторыми веществами, входящими в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных тканей, прозрачных в видимом свете. Свойством поглощать УФ-лучи обладают высокомолекулярные соединения, такие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические аминокислоты (тирозин, триптофан, метилаланин), пуриновые и пиримидиновые основания и др. С помощью УФ-микроскопии изучают локализацию и количество таких веществ, а при исследовании живых объектов — их изменения в процессе жизнедеятельности. Инфракрасная микроскопия применяется в медицине преимущественно в нейроморфологии и офтальмологии.
Для специальных целей в патологии используются и другие микроскопические методы — интерференционная, стереоскопическая микроскопия и др.
Электронная микроскопия
ЭМ применяют для изучения структуры клеток, микроорганизмов и вирусов на субклеточном и макромолекулярном уровнях. Значительную разрешающую способность ЭМ обеспечивает поток электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. При трансмиссионной ЭМ электроны проходят через структуры исследуемого объекта, а при сканирующей ЭМ они отражаются от этих структур, отклоняясь под разными углами. В результате возникает изображение на люминесцирующем экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) ЭМ получают плоскостное изображение внутриклеточных структур, при сканирующей — объёмное. Весьма полезно сочетание ЭМ с другими методами — авторадиографией, гистохимическими, иммунологическими методами. Возникает возможность наблюдать течение биохимических и иммунологических процессов в клетке в сочетании с изменениями внутриклеточных структур. ЭМ требует специальной химической или физической фиксации тканей. Для исследования берут в основном биопсийный материал. Может быть использован и секционный материал, но в максимально короткие сроки после смерти, обычно исчисляемые минутами. После фиксации ткани обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на ультратомах. При этом получают ультратонкие срезы тканей толщиной 30—50 нм. Их контрастируют, переносят на специальные металлические сетки и затем изучают в ЭМ.
При ультратомировании препарата можно получить так называемые полутонкие срезы толщиной 1,5 мкм, которые после окраски метиленовым синим исследуют в СМ. Это позволяет получить представление о состоянии той ткани, клетки которой будут затем изучены в ЭМ. Метод может иметь и самостоятельное значение.
В сканирующем (растровом) ЭМ исследуют поверхность биологических и небиологических объектов, напыляя в вакуумной камере на их поверхность электроноплотные вещества и изучая эти реплики, повторяющие контуры объекта исследования.
Методы окрашивания
Микроскопические методы используют в медицине в сочетании с гистологическими методами исследования клеток и тканей. Для этого, как правило, фиксированные тканевые срезы должны быть окрашены с целью выявления различных клеточных структур. Последние воспринимают красители в зависимости от их физико-химических свойств. Поэтому красители подразделяют на основные, кислые и нейтральные.
Основные, или базофильные, красители являются красящими основаниями или их солями (гематоксилин, метиленовый синий, толуидиновый синий и др.). В цветовой гамме этих красителей преобладают оттенки синего цвета. Интенсивность окраски (базофилия) зависит от числа кислотных групп в структурах клетки, способных взаимодействовать с основными красителями. Кислые, или ацидофильные, красители — красящие кислоты или их соли, окрашивающие клеточные структуры в различные оттенки красного (эозин, эритрозин, Конго красный, оранж и др.). Нейтральные, красители содержат и базофильные, и ацидофильные вещества (например, смесь Романовского—Гимзы). Такие красители могут обладать способностью растворяться в определённых веществах, окрашивая их (судан III, шарлах и др.). Нередко для контрастирования структур клеток или тканей используют методы, основанные на способности этих тканей удерживать или восстанавливать соли тяжёлых металлов (серебра, золота, осмия, свинца и др.). Эти методы контрастирования называются импрегнацией, они используются как в СМ, так и в ЭМ.
С помощью различных красителей в повседневной и научной практике применяют обзорные окраски для составления общего представления о состоянии исследуемой ткани (гематоксилин и эозин, азур-фукселин и др.), а также специальные окраски для выявления особенностей процессов, протекающих в тканях и клетках. Так, используют окраску Суданом III для выявления жировой дистрофии клеток, Конго красным — для определения отложений амилоида, импрегнацию серебром — для исследования нервной ткани и т.п. Живые и неокрашенные объекты исследуют с помощью специальных микроскопических методов, описанных выше.
Гистохимические методы
Гистохимические и гистоферментохимические методы позволяют проследить и оценить обмен веществ в тканях и клетках в норме и вусловиях патологии; избирательно оценить метаболизм белков, липидов, углеводов и других метаболитов, локализацию и активность ферментов и гормонов, проанализировать особенности окислительно-восстановительных процессов, протекающих в клетках и тканях в условиях патологии, при приспособлении и компенсации. Диапазон применения гистохимических методов в патологии необычайно широк. Для гистохимических исследований используют срезы свежезамороженных тканей, приготовленные в криостате, что позволяет сохранить прижизненную локализацию того или иного химического соединения. Гистохимические методы часто сочетают с другими методами СМ и ЭМ. Для количественной оценки результатов гистохимических реакций применяют гистофотометрию, цитофотометрию, микрофлюорометрию и др.
Цитологическое исследование мазков, соскобов и отпечатков
Традиционными методами, используемыми патологоанатомами для диагностики различных заболеваний, являются цитологическое исследование мазков, соскобов и отпечатков ткани из различных органов и морфологическое изучение замороженных или заключённых в парафин биоптатов органов и тканей. Цитологические исследования позволяют дать предварительный диагноз в течение 20—30 мин, они широко применяются в поликлинической и хирургической практике. Однако при цитологическом исследовании нарушаются взаимоотношения между различными клетками и внеклеточным матриксом. Кроме того, в цитологическом образце могут отсутствовать отдельные типы клеток. Поэтому цитологические данные часто носят предварительный характер, а окончательный диагноз ставят после морфологического исследования биоптата через 4—5 дней. Использование срезов, полученных из замороженной ткани (криостатных срезов), позволяет ускорить обработку материала до 1—2 ч, но за счёт ухудшения морфологической картины. В связи с этим исследование биопсийного материала, заключённого в парафин, остаётся основным подходом в патологоанатомической диагностике. Очень информативна иммуноцитохимия. Используя специфические AT и эффективные системы их визуализации, можно получить данные, определяющие выбор терапии заболевания и его прогноз. Особенно эффективно использование этих методик при диагностике опухолей, иммунных, аутоиммунных и воспалительных процессов.