Особистий внесок здобувача полягає в підготовці та проведенні експериментальних досліджень. Усі експериментальні дані, використані в дисертації, отримані при безпосередній участі автора роботи. Інтерпретацію одержаних результатів, висновків здійснено разом з науковим керівником – професором Л.М. Тарасенко.
Апробація результатів дисертації. Основні положення результатів роботи оприлюднені на: IX Международном конгрессе по клинической патологии (Бангкок, Таиланд 15-23 февраля 2004), міжнародній науково-практичній конференції “Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної медицини” (Тернопіль, 11-12 листопада 2004), ІV Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004), 59 міжнародній науково-практичній конференції студентів та молодих вчених НМУ ім. О.О. Богомольця “Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 6-8 квітня 2005), ІХ Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих учених (Тернопіль, 21-22 квітня 2005), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії” (Чернівці, 18-20 травня 2005), Международном молодежном медицинском Конгрессе ”Санкт-Петербургские научные чтения” (Санкт-Петербург, Россия, 7-9 декабря 2005), підсумковій науковій конференції молодих учених “Медична наука – 2005” (Полтава, 2005), X Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих учених (Тернопіль, 11-13 травня 2006), на засіданні Полтавського відділення Українського біохімічного товариства (січень, 2006); ХІ Конгресі Світової федерації українських лікарських товариств (Полтава, 28-30 серпня 2006), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 24-27 жовтня 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 друкованих робіт, з них 8 статей, 10 робіт в матеріалах і тезах конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 142 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків та списку літератури, який включає 111 джерел кирилицею та 60 латиницею. Робота ілюстрована 18 рисунками і 32 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури складається з шести підрозділів, в яких розглянуті сучасні поняття про структурну організацію кісткової тканини, механізми її мінералізації, шляхи регуляції метаболічних процесів в кістковій тканині (КТ). Викладені питання щодо впливу емоційного стресу (ЕС) та недостатності гонад (НГ) на стан кісткової тканини, а також принципи корекції структурно-функціональних змін в КТ.
Матеріали та методи дослідження. Експерименти виконані на 220 статевозрілих щурах обох статей лінії Вістар масою 157-200 г віком 4-6 місяців. Тварин утримували на звичайному раціоні віварію в стандартних умовах. Експерименти виконані з урахуванням сезонних і добових біоритмів. Кожна серія досліджень мала відповідну контрольну групу. Попередньо проводили рандомізацію тварин за масою тіла. При проведенні експериментальних досліджень дотримувались рекомендацій щодо медико-біологічних досліджень згідно міжнародних принципів Європейської конвенції “Про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілях” (Страсбург, 1985) та норм біомедичної етики, відповідним Законам України “Про захист від жорстокого поводження” (Київ, 2006). Емоційний стрес моделювали за методом Є.А. Юматова та співавт. (1988), в основі якого лежить відтворення природної зоосоціальної конфліктної поведінки. Щурів (від 2 до 4) індивідуально фіксували за хвіст до дна клітки щоденно по 5 годин впродовж 4 днів. На четвертий день відтворення ЕС проводили евтаназію тварин під гексеналовим наркозом (50 мг/кг маси). Для оцінки розвитку ЕС були використані наступні критерії: маса наднирників, тимуса, селезінки та частота і множинність виразок слизової оболонки шлунка. Дана модель ЕС характеризується підвищенням концентрації стресогенних гормонів - катехоламінів та глюкокортикоїдів в крові (Юматов Е.А., 1988). Недостатність гонад моделювали шляхом оваріоектомії самок та тестектомії самців за методом Я.Д. Кіршенблата (1969) під ефірним наркозом за 20 днів до початку відтворення ЕС.
Корекцію метаболічних змін в кістковій тканині проводили напередодні моделювання емоційного стресу введенням peros чоловічих та жіночих статевих гормонів шляхом використання препаратів: “Андріол” (10 мкг/кг) (Schering, Німеччина) та “Фемостон” (10 мкг/кг) (SolvayPharmaceuticals, Нідерланди). Дозу препаратів розраховували, виходячи з мінімальної терапевтичної дози для тварин, а також з урахуванням вмісту відповідних гормонів у препаратах (Западнюк І.П., 1983; Поворознюк В.В. та ін., 2004). Корекцію кальцитоніном проводили напередодні моделювання ЕС введенням підшкірно препарату кальцитоніна лосося “Міакальцик” (0,2 мкг/кг) (Novartis, Норвегія). Дозу введення препарату розраховували, виходячи з мінімальної терапевтичної дози та з урахуванням того, що 1 одиниця препарату (МЕ) відповідає концентрації гормона, який викликає у щурів зниження на 10% рівня кальцію в крові (Поворознюк В.В., 1999).
Стан неколагенових білків (протеогліканів та глікопротеїнів) КТ оцінювалі шляхом визначення в різних відділах скелету (нижній щелепі, стегновій кістці та хребцях) специфічних біополімерів протеогліканів (гексуронових кислот, фракцій глікозаміногліканів: гіалуронової кислоти, хондроїтин-4- (ХС-4) та хондроїтин–6-сульфатів (ХС-6)) і глікопротеїнів (фукози та N-ацетилнейрамінової кислоти (NANA)) (Леонтьев В.К., 1975; Герасимова А.М., 1986; Шараев П.Н., 1987; Камышников В.С., 2000; DischeJ., 1956; ВitterA. etal., 1968).
В мінералізаті КТ визначали вміст кальцію, фосфору (Леонтьев В.К. и др., 1976; Камышников В.С., 2000). Кількісну оцінку стану КТ проводили за показниками щільності (г/см3) та об’ємного вмісту мінеральних речовин (мінеральна насиченість, г/см3) в сухих знежирених фрагментах кістки. Ступінь мінералізації органічного компоненту визначали за співвідношенням маси мінеральних речовин до маси досліджуваного фрагменту (зольність, %) (Ступаков Г.П. и др., 1989). Для оцінки ступеня резорбції альвеолярного відростка нижньої щелепи визначали коефіцієнт оголення коренів молярів (Николаева А.В. и др., 1965).
Гістохімічні дослідження виконані сумісно з професором Дєдух Н.В. (гістологічна лабораторія Інституту патології хребта та суглобів ім. М.І. Сітенка (м. Харків)). Для дослідження у тварин виділяли альвеолярну кістку нижніх щелеп, стегнову кістку та тіла хребців L4-L5. Мікроскопічний аналіз матеріалу та фотографування проводили під мікроскопом CarlZeiss за допомогою цифрової камери Canon.
Статистичну обробку результатів проводили за допомогою Excel 97 – додатка до пакету програм MicrosoftOffice 97 з використанням параметричних та непараметричних критеріїв оцінки розбіжності між вибірками.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Нами встановлено, що за умов ЕС в кістковій тканині нижньої щелепи концентрація N-ацетилнейрамінової кислоти підвищилась в 1,2 рази у тварин обох статей порівняно з контролем (табл. 1). У самців спостерігалось також підвищення в 1,3 рази NANAв тканині стегнової кістки (див. табл. 1). Такий характер змін свідчить про підвищену деградацію глікопротеїнів КТ за умов ЕС. Недостатність гонад призвела до достовірних змін показника тільки в КТ стегна у самців.
Таблиця 1
Концентрація N-ацетилнейрамінової кислоти в кістковій тканині
різних відділів скелету за умов емоційного стресу та поєднаної дії
емоційного стресу та недостатності гонад у щурів обох статей (M+m)
| Характер досліджень | N-ацетилнейрамінова кислота, мкмоль/г | ||
| нижня щелепа | стегнова кістка | хребці | |
| Самці | |||
| 1. Інтактні (n=17) | 1,97+0,06 | 1,70+0,06 | 2,15+0,09 |
| 2. Емоційний стрес (n=22) | 2,37+0,18* | 2,30+0,20* | 2,36+0,13 |
| 3. Тестектомія (n=9) | 1,99+0,08 | 2,00+0,06^ | 2,13+0,15 |
| 4. Емоційний стрес + тестектомія (n=11) | 2,60+0,13** | 2,45+0,14** | 2,21+0,09 |
| Самки | |||
| 1. Інтактні (n=14) | 1,60+0,09 | 1,56+0,08 | 1,68+0,03 |
| 2. Емоційний стрес (n=17) | 1,99+0,08* | 1,70+0,14 | 1,73+0,09 |
| 3. Оваріоектомія (n=12) | 1,89+0,16 | 1,59+0,08 | 1,77+0,07 |
Примітка. *- Р1-2<0,05; ^ - P1-3<0,05;
** - Р1-4<0,05; # - P1-4<0,01.
Поєднаний вплив ЕС та НГ призвів до максимального підвищення рівня N-ацетилнейрамінової кислоти в КТ нижньої щелепи та стегнової кістки щурів обох статей: в 1,3 рази в КТ нижньої щелепи у самців, в 1,7 рази - у самок; в тканині стегнової кістки – в 1,4 рази у щурів обох статей (див. табл. 1). Отже, поєднана дія вказаних патогенних факторів підсилює катаболізм органічного матриксу КТ у тварин обох статей порівняно з їх парціальною дією. Результати наших досліджень свідчать про те, що рівень фукози достовірно не змінювався внаслідок парціальної дії ЕС та НГ у тварин обох статей. Тільки поєднана дія ЕС та тестектомії призвела до достовірного підвищення рівня фукози в КТ самців порівняно з інтактними (1,37+0,08 та 1,72+0,06; Р<0,05).
Одержані нами дані підтверджують відомості про те, що в КТ вміст глікопротеїнів, до складу яких входить фукоза, незначний. Крім цього є підстави стверджувати, що визначення концентрації NANA в КТ може бути більш інформативним показником для оцінки метаболізму глікопротеїнів, ніж визначення вмісту фукози. Відомо, що NANA займає кінцеве положення в олігосахаридному ланцюзі глікопротеїнів, і, можливо, саме тому останні являються більш вразливими до дії патогенних впливів.