Способы иммунизации. Введение иммуногена приводит к активации лимфоидных клеток, расположенных вблизи от места инъекции. Наиболее эффективно вводить иммуноген малыми порциями в большое количество точек. Введение иммуногена можно осуществлять различными способами.
Внутрикожное введение. На очищенном от шерсти участке кожи животного делают острым скальпелем несколько царапин, а затем втирают в это место раствор иммуногена. Применение этого способа позволяет получать высокий иммунный ответ уже после однократного введения, в результате чего значительно сокращается расход иммуногена. Однако описанный способ трудоемок в исполнении и обычно вызывает сильные болевые ощущения у животного от обширных участков изъязвлений в местах введения иммуногена.
Подкожная иммунизация. В точки, расположенные вдоль позвоночника животного, вводят 5-6 порций раствора иммуногена объемом приблизительно 2 мл.
Внутримышечное введение. Одновременно часть иммуногена вводят в мышцу задних ног животного и небольшими порциями.
Внутрибрюшинное введение. Этот способ используют для иммунизации мелких лабораторных животных, таких, как мыши или морские свинки.
Прямое введение иммуногена в лимфатические узлы. Иммуноген инъецируют в лимфоидные узлы, расположенные в подколенной ямке задних ног кролика, что позволяет уменьшить его количество до 10-50 мкг, а объем вводимого раствора - до 25 мкл. Этот способ является сложным в техническом исполнении, поскольку включает в себя разрез кожи, поиск лимфоузла и введение иммуногена без его повреждения.
Внутривенное введение. Этот способ обычно применяется для повторных инъекций, после которых проводят отбор крови у животного. Раствор иммуногена вводят непосредственно в кровоток. Адъювант в этом способе введения антигена не применяется, поскольку он оказывает токсический эффект и животное может погибнуть.
Более редко используются такие способы иммунизации, как введение иммуногена в подушечки лап или в конъюнктиву глаза, которые вызывают сильные болевые ощущения у животного. Иммунизацию начинают введением животному иммуногена в смеси с полным адъювантом Фрейнда, а для повторных инъекций применяют неполный адъювант Фрейнда. Перед отбором крови за 7 - 9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. Число инъекций и интервалы между ними чаще всего подбираются экспериментально для конкретного иммуногена.
В процессе иммунизации у животных отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. В том случае, когда иммуногеном являются клетки микроорганизмов, максимально высокий уровень антител наблюдается гораздо раньше. После окончания первого цикла иммунизации животному в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Ниже приводятся схемы иммунизации морских свинок и кроликов инсулином и конъюгатом тироксин - бычий сывороточный альбумин.
Для получения антисывороток морских свинок к инсулину свиньи проводят многоточечные инъекции инсулина подкожно, внутримышечно и внутрибрюшинно по следующей схеме: 1, 8, 15-й день - 200 мкг инсулина в 0,5 мл физиологического раствора смешивают с 0,5 мл полного адъюваита Фрейнда и вводят животному. После 30 дней отдыха животному в течение 3 дней ежедневно вводят антиген путем многоточечных инъекций по схеме: 45, 46, 47-й день - 150 мкг инсулина в 0,7 мл физиологического раствора. Отбор крови проводят через 7-9 дней из сердца.
Второй цикл иммунизации осуществляется после месячного отдыха животных по схемам 45, 46 и 47 дней.
Для получения антисывороток с титром, удовлетворительным для проведения ИФА, часто требуется 4-5-кратное повторение циклов иммунизации. Отбор крови каждый раз проводится на 7 - 9-й день после последней инъекции.
Иммунизацию кроликов конъюгатом тироксин - БСА проводят многоточечными инъекциями вдоль позвоночника и внутримышечно в область микроузлов задних лап по следующей схеме: 1-й день - 1-2 мг конъюгата.
T4 - БСА в 0,7 мл физиологического раствора смешивают с 0,7 мл адъюванта Фрейнда и полученную эмульсию вводят животному; 31, 32, 33 или 45, 46, 47-й дни - внутривенно вводят 0,7-1 мл физиологического раствора, содержащего 1-2 мг T4 - БСА.
Кровь берут из сердца на 7-9-й день после последней инъекции. Через месяц цикл внутривенной иммунизации, повторяют.
Отбор крови и получение антисыворотки. Иммунизированное животное используется в качестве донора иммунной сыворотки в течение 5-7 мес, за это время удается провести 5-6 циклов иммунизации. Животных, прошедших несколько циклов иммунизации, называют гипериммунными. Кровь у животных отбирают из вены уха или непосредственно из сердца путем кардиальной пункции в объеме 50-70 мл у кролика и 5-10 мл у морской свинки в стерильные пробирки, промытые стерильным буферным раствором.
Кровь, лишенная клеточных элементов, называется плазмой. В плазме содержится фибриноген, приводящий к образованию во всем объеме пробирки сгустка фибрина, который осторожно удаляется центрифугированием при 1000-2000 об/мин в течение 15 мин. Плазма, лишенная фибрина, называется сывороткой. Для удаления белков системы комплемента сыворотку прогревают в течение 30 мин при 56°С, при этом антитела сохраняют свою активность. Обработку крови и получение сыворотки надо проводить с максимальной осторожностью, избегая разрушения эритроцитов. Наличие внутриклеточных белков и ферментов в сыворотке может приводить к появлению дополнительного фона в некоторых модификациях иммуноферментного анализа. Это замечание касается прежде всего использования антисывороток в гомогенных методах.
Хранение антисывороток. Нативную иммунную сыворотку можно хранить 3-6 мес без потери иммунологической активности в замороженном состоянии при - 20°С, предварительно разливая ее во флаконы по 0,5-1 мл. Отмораживание-замораживание ведет к снижению иммунологической активности сыворотки, поэтому лучше замораживать ее небольшими порциями для одноразового употребления.
Удобно хранить антисыворотку в лиофилизованном состоянии в ампулах под вакуумом. В сухом виде антисыворотка сохраняет иммунологическую активность при комнатной температуре в течение 1-2 лет.
Размороженную или разведенную сухую сыворотку в растворе можно хранить при +4°С в течение недели, предварительно добавив в нее консервант - хлороформ, 0,1% азида натрия или 0,01% мертнолата. Следует иметь в виду, что консерванты могут быть ингибиторами ферментов-маркеров в иммуно-феремнтном анализе.
Для увеличения относительного количества антител обычно используют г-глобулиновую или IgG-фракции иммунной сыворотки. Наиболее полное выделение г-глобулиновой фракции без снижения ее иммунологической активности достигается при осаждении сульфатом аммония, после чего осадок длительно диализуется с частой сменой буферных растворов.
Другим широко распространенным способом является осаждение полиэтиленгликолем с Air=4000-6000. В 10% -иом растворе полиэтиленгликоля происходит агрегация всех белков с Мг> ~> 150 000, в результате чего осаждаются белки г-глобулиновой фракции, а белки меньшей молекулярной массы остаются в растворе. Этот метод позволяет очень быстро получить препарат г-глобулиновой фракции антисыворотки. Способ достаточно эффективный, если препарат не подвергается хранению при низких температурах. Длительное хранение полученного препарата с сохранением иммунологической активности возможно после предварительного тщательного диализа.
Антитела в большей части антигенов относятся к IgG-фракции иммунной сыворотки. С целью повышения чувствительности и специфичности анализа во многих случаях полезно использовать для сорбции на твердой фазе и для получения конъюгатов IgG-фракцию нативной сыворотки. Наиболее простой и доступный способ выделения IgG - метод ионообменной хроматографии на ДЗАЭ-сефадексе или ДЗАЭ-целлюлозе.
Выделение IgG-фракции кроличьей аитисыворотки.
1. 10 мл аитисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 MNaCl1 добавляют 6,26 г 2SO4, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°С.
2. Выпавший осадок удаляют цеитрифугироваиием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре.
3. После удаления осадка центрифугироваиием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером.
4. IgG-фракцию определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 им, концентрацию рассчитывают, используя коэффициент молярного поглощения е=1,5 г-'-л-см-1.
Приготовление фосфатного буфера.
Для выделения IgG кролика используют 50 мМ фосфатный буфер, содержащий 20 мМ ЭДТА.8 г Na2HPO4 ·2З20 н 7,4 г ЭДТА-Na растворить в 900 мл воды, довести рН до 8 IMNaOH и затем добавить воды до 1 л.
Выделение антител методом иммуносорбции. Специфичность сыворотки проверяется в реакциях с используемым для иммунизации препаратом антигена и с набором близких ему по структуре химических соединений. В случае недостаточна очищенного антигена возможны неспецифические реакции, обусловленные наличием антител к применяемым антигенам. Перекрестные реакции с другими соединениями могут наблюдаться при наличии у них химических структур, близких к структуре антигенных детерминант иммуногена.
Удаление неспецифических антител из антисыворотки обычно осуществляют с помощью метода адсорбции на соответствующем неспецифическом антигене. Адсорбция неспецифических антител в реакции преципитации с растворимой фракцией путем центрифугирования может привести к появлению в антисыворотке или растворимых комплексов At-Ar, или избытка добавленного Ar, присутствие которых влияет на способность антисыворотки реагировать со сцецифическим антигеном в ИФА. Наиболее удобно для адсорбции антисыворотки использовать антиген, иммобилизованный на твердой фазе. Добавляя такой иммуносорбент в антисыворотку или пропуская антисыворотку через колонку с иммуносорбентом, можно быстро освободиться от перекрестно реагирующих антител.