Получение антисывороток и поликлональных антител (стр. 4 из 4)
На рис. приведены кривые связывания иммобилизованных на полистироле антител к инсулину с конъюгатом инсулин - пероксидаза. Исследуемые сыворотки различаются по значениям эффективных констант равновесия. Для количественного определения инсулина могут быть использованы антисыворотка и конъюгат, эффективная константа связывания которых ~109M-1. Для других тест-систем допустимое значение Кзф будет определяться требованиями, предъявляемыми к чувствительности и точности разрабатываемого метода.
Описанная процедура скрининга иммунных сывороток, как отмечалось выше, применима при наличии конъюгата антиген – фер.
Связывание конъюгата инсулин - пероксидаза с адсорбированными на полистирольном планшете антителами против инсулина, выделенными из разных сывороток: по оси ординат - оптическая плотность А при 490 нм продукта пероксидазной реакции окислення о-фенилендиамина перекисью водорода. Константы связывания антител из сывороток / и 2 равны Ю'о н 109 соответственно; N-контрольная нормальная сыворотка.
Получение такого конъюгата для широкого круга антигенов представляется непростой задачей. Более универсальным реагентом являются антитела, меченные ферментом, поэтому остановимся на более общем подходе к определению аффинности антител в сыворотке или асците, основанном на твердофазном ИФА. Этот метод, предложенный Б. Фриге, позволяет определять константу связывания антител с антигеном при их взаимодействии в растворе.
Постановка метода включает две основных стадии:
1) проведение реакции антиген - антитело в растворе;
2) определение концентрации антител после установления равновесия с помощью метода твердофазного ИФА. Схема реакции в растворе в общем случае имеет вид
Обозначим равновесную концентрацию связанных антител как Bp, а концентрацию свободного антигена как Fj,, тогда можно записать следующее выражение:
Если концентрации антител 0 и определять методом непрямого твердофазного ИФА, то при определенных условиях проведения эксперимента. будет выполняться соотношение / о=Л/Л0, где А и A0 - значения оптических плотностей, регистрируемых в ИФА, соответствующие концентрациям антител и о. Уравнение Клотца при этом условии может быть приведено к виду
Таким образом, для определения Клописанным выше методом необходимо знание начальной концентрации антител о. Однако практически нахождение Клпроводится в иммунных сыворотках, или асцитах, где точная концентрация антител |Ат] о неизвестна. Если проводить реакцию комплексообразоваиия в избытке антигена, то количество связавшегося антигена незначительно по сравнению с исходным и его концентрация после установления в системе равновесия будет близка к исходной ф е.0 да. Fp. Если эксперимент проводится так, что выполняется условие о > 10 о, то
полученные радиоактивной меткой.
Если представить экспериментальные данные в координатах A0/-=-1/0> то по тангенсу угла наклона прямой можно рассчитать Кд.
Определение константы диссоциации комплекса пероксидаза - антитела к пероксидазе в координатах Клотца: кривые 1 я 2 соответствуют значениям Cd1,1 ·10-9 и 2.2 ·10-9 M.
Кинетика связывания моноклональных антител с инсулином, адсорбированным иа полистирольном планшете для ИФА из раствора концентрации 1 мкг/мл. Комплекс инсулин - антитело выявлен меченными пероксидазой антимышинными IgG:
Таким образом, для практического осуществления' описанного метода необходимо, прежде всего, установить наличие линейной зависимости между концентрацией определяемых непрямым методом ИФА антител и регистрируемым значением оптической плотности. Для этого готовят серии разведений исследуемой иммунной сыворотки и изучают их связывание в непрямом методе ИФА. Обычно эти зависимости имеют, вид кривых с насыщением. Для проведения эксперимента выбираются разведения антисыворотки, лежащие в линейном диапазоне кривой. Для установления равновесной константы диссоциации комплекса Ar·At концентрацию антигена варьируют в диапазоне от 10-6 до 10-8 М. На рис. приведен график для определения Клкомплекса ПХ-Ат. Однако вычисленные этим методом значения констант диссоциации комплекса At•Ar являются эффективными, поскольку при выборе уравнения не учитывается влияние взаимодействия антител с антигеном, сорбированным на твердой фазе, на равновесие в растворе.
Экспериментально контроль влияния иммобилизованного антигена на равновесие в реакции Ar-At врастворе осуществляется сравнением сигналов, полученных на стадии твердофазного ИФА в двух соседних рядах лунок. Для этого содержимое лунок одного ряда переносится во второй свободный, обработанный аналогично первому, после чего сравнивают значения сигналов. Если наблюдаемые различия не превышают 10%, то можно полагать, что влияние иммобилизованного антигена на равновесия Ar-At врастворе незначительно.
Более точная оценка общего случая с учетом влияния иммобилизованного антигена может быть дана в рамках модели связывания лиганда с несколькими независимыми центрами связывания:
Если К* - константа связывания антител с иммобилизованным центром связывания, а,· - концентрация различных субпопуляций антител, связывающихся с иммобилизованным антигеном, то нетрудно показать, что в этом случае окончательное выражение уравнение Клотца будет иметь вид
Обозначим
как С. Параметр С для реакций ряда антигенов был найден экспериментально, значение его не превышает 2-2,5. При этом оценка С получена в предположении, что реакция антител с иммобилизованным антигеном достигает равновесия. Кинетика этого процесса представлена на рис., из которого видно, что время установления равновесия значительно больше используемого в эксперименте при определении константы. Поэтому полученное значение С является максимальным и максимальная ошибка, которая допускается при определении Ku, составляет 200-250%.Метод может быть использован для вычисления констант связывания как поликлональных, так и моноклональных антител.