Апробація роботи відбулася 28 квітня 2005 р. на міжкафедральній конференції в Азербайджанському медичному університеті (м. Баку), а також на конференції молодих вчених у Національному фармацевтичному університеті (м. Харків, 2007 р.),1 інформаційні лист.
Публікації. Основні положення дисертації опубліковані у 5 статтях провідних фахових видань, 1 тезах та 1 інформаційному листку.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 155 сторінці комп'ютерного тексту і складається з вступу, 5 глав, висновків, практичних рекомендацій, списку літератури, який включає 187 джерела, з яких 153 – іноземних авторів. Робота ілюстрована 39 таблицями і 45 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. У результаті аналізу літературних джерел щодо протитуберкульозних препаратів для подальших досліджень були обрані рифампіцин, рифабутин, офлоксацин, канаміцин та ізоніазид, а також дві комбінації: ізоніазид + офлоксацин + рифабутин та ізоніазид + канаміцин + рифампіцин.
Враховуючи те, що рівень імунореактивності організму має важливе значення при призначенні хіміотерапії при туберкульозі, нами були досліджені показники імунітету тварин і людей, хворих на туберкульоз легенів.
Експерименти з доклінічного вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на імунітет тварин проводили на щурах і морських свинках. У досліді використані 320 статевозрілих морських свинок обох статей масою 280-305 г і 360 щурів інбредної лінії (WAG Wistar albina glaxo) масою 180-200 г. Під час експерименту тварини знаходилися у стандартних умовах у віварію згідно прийнятих санітарно-гігієнічних умов. Робота з тваринами проводилася відповідно до принципів Європейської конвенції із захисту лабораторних тварин з дотриманням норм GLP.
В експерименті тварин поділяли на 6 груп. У кожній групі було по 60 щурів або 30 морських свинок. Проводили дослідження крові, селезінки та легенів дослідних тварин.
Оцінку стану імунної системи тварин і пацієнтів проводили за допомогою визначення фагоцитарної активності лейкоцитів, уніфікованих методом інкубації культури клітин з частками латексу, а також за тестом з нітросинім тетразолієвим, методиками визначення Е-, ЕАС-, авторозіткоутворюючих клітин при змішуванні крові морських свинок і щурів між собою, визначенням гемолітичної активності сироватки шляхом розведень.
Підрахунок клітин здійснювали загальноприйнятим методом з використанням гемоцитометру (камери Горяєва). Для підрахунку ядровміщуючих клітин застосовували 2% розчин оцтової кислоти.
Вивчення морфології клітин, мієлограм і лейкограм крові проводили у мазках, виготовлених із суспензій клітин і забарвлених азур-ІІ-еозином за Романовським – Гімзе. У кожному мазку вивчали 300 клітин.
У крові тварин і хворих на туберкульоз людей визначали також рівень гемоглобіну, швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ) і лейкоцитарну формулу. Їх вивчали за загальноприйнятими методиками клінічного аналізу крові.
Для оцінки утворення активних форм кисню фагоцитами як показника імунореактивності організму використовували метод спонтанної та індукований зимозаном люмінолзалежної хемілюмінесценції (ЛЗХЛ).
Для більш глибокого дослідження також проведено визначення гемолітичної активності сироватки крові здійснювали за методикою, розробленою Антипенскою Л.В.
Здатність лімфоцитів селезінки щурів формувати Е-розітки з еритроцитами морської свинки і, відповідно, лімфоцитів морської свинки з еритроцитами щурів визначали за методом JondalM.
Відносну кількість В-лімфоцитів визначали у реакції ЕАС-розіткоутворення.
Циркулюючі імунні комплекси визначали за методом Караулова А.В. за допомогою реакції преципітації з подальшим визначенням оптичної щільності на фотоколоримітрі.
У клінічній частині експерименту було обстежено понад 60 хворих на інфільтративний туберкульоз легенів у віці від 18 до 59 років, які знаходилися на стаціонарному лікуванні у клініці НДІ легеневих захворювань за період з 2002 до 2005 рр. Серед обстежених переважали чоловіки – 45 (75%), жінок було 15 (25%). Контрольну групу склали 20 практично здорових осіб, аналогічних за статтю і віком до дослідних груп.
У роботі використані результати обстеження традиційними клініко-рентгенологічними і лабораторними методами, а також проведене вивчення імунного статусу. При дослідженні клітинного, гуморального імунітету, а також параметрів неспецифічного захисту застосовувалися імунологічні методи, що використовували у доклінічних дослідженнях, а також додаткові. Так, субпопуляційний склад лімфоцитів периферичної крові (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD21+, CD25+, CD69+) визначали методом проточної цитофлюориметрії. Експресію поверхневих маркерів Т-лімфоцитів визначали за стандартною методикою імунофенотипування з використанням венозної периферичної крові, взятої з ліктьової вени та змішаної з гепарином (25 ОД/мл).
Мононуклеарні клітини виділяли методом центрифугування у градієнті фікол-верографін із щільністю 1,077 г/см3 за A.Boyum. Концентрацію і підрахунок мононуклеарних клітин визначали у камері Горяєва.
Активаційну і проліферативну здатність лімфоцитів оцінювали за адаптованою методикою Павлюк А.С.
Кількісне визначення імуноглобулінів сироватки крові проводили методом радіальної імунодифузії за Манчіні.
Фагоцитарну активність нейтрофілів визначали за нітросинім тетразолім (НСТ) тестом.
За методикою М.Л.Біленького проводили дослідження люмінолзалежної хемілюмінісценції (ЛЗХЛ) фагоцитуючих клітин.
Статистичну обробку отриманих у дослідженнях результатів здійснювали за допомогою параметричних методів аналізу за допомогою коефіцієнта Стьюдента, а також непараметричними методами аналізу з використанням програми Statistica (StatSoft, USA).
Результати досліджень та їх обговорення. Першим етапом наших досліджень було вивчення впливу монотерапії протитуберкульозними препаратами на імунітет експериментальних тварин – щурів і морських свинок.
Вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на показники периферичної крові щурів і морських свинок показало, що у всіх експериментальних групах спостерігалися зміни гематологічних показників (табл. 1, 2).
Таблиця1
Показники периферичної крові при експериментальному туберкульозі у щурів (M± m)
| Групи | Гемоглобін, г/л | ШОЕ, мм/год. | Кількість лейкоцитів, ´ 109 |
| Контрольна група | 120,0 ± 3,2 | 1,0 ± 0,02 | 6,2 ± 0,05 |
| Після зараження | 129,1 ± 2,6 | 2,0 ± 0,03* | 7,7 ± 0,03* |
| З офлоксацином | 116,1 ± 2,0 | 1,0 ± 0,03 | 6,5 ± 0,04 |
| З канаміцином | 105,1 ± 3,0 | 1,5 ± 0,01 | 4,8 ± 0,05 |
| З рифампіцином | 106,1 ± 2,6 | 1,5 ± 0,02 | 5,6 ± 0,6 |
| З рифабутином | 118,0 ± 2,2 | 1,0 ± 0,01 | 6,4 ± 0,03 |
Примітка. * – Достовірність розходжень с контрольною групою.
Таблиця2
Показники периферичної кровіу експериментальних морських свинок(M± m)
| Групи | Гемоглобін, г/л | ШОЕ, мм/год. | Кількість лейкоцитів, ´ 109 |
| Контрольна група | 112,0 ± 5,3 | 3,0 ± 0,02 | 6,6 ± 0,5 |
| Після зараження | 123,0 ± 5,9* | 5,0 ± 0,06* | 8,4 ± 0,3* |
| З офлоксацином | 116,0 ± 5,0 | 3,0 ± 0,03 | 6,9 ± 0,6 |
| З канаміцином | 105,0 ± 4,2* | 4,5 ± 0,01* | 5,7 ± 0,8 |
| З рифампіцином | 118,0 ± 4,0 | 5,0 ± 0,03* | 5,9 ± 0,2 |
| З рифабутином | 115,0 ± 2,0 | 4,0 ± 0,02* | 6,8 ± 0,5 |
Примітка. * – Достовірність розходжень с контрольною групою.
Рівень гемоглобіну в обох видів тварин після їх зараження туберкульозною паличкою підвищувався. Призначення канаміцину морським свинкам і щурам призводило до зниження гемоглобіну до рівня, що був нижче, а ніж у здорових тварин. Застосування рифампіцину призводило до зниження рівня гемоглобіну в щурів нижче норми, а у морських свинок показник повертався практично до контрольних значень. Терапія офлоксацином і рифабутином сприяла поверненню гемоглобіну до вихідного рівня(в обох видів тварин). Тобто призначення канаміцину і рифампіцину морським свинкам і щурам несприятливо впливало на кровотворення.
Показник ШОЕ у заражених щурів збільшувався в 2 рази, а в морських свинок – у 1,7 рази. Призначення офлоксацину повертало цей показник в обох видів тварин до рівня здорових. Те ж саме спостерігали після застосування рифабутину в щурів, а у морських свинок ШОЕ була на 33,3% вищою.
Після застосування канаміцину і рифампіцину ШОЕ, у порівнянні з групою контролю, збільшувалася у 1,5 рази у щурів. У морських свинок призначення канаміцину і рифампіцину мало впливало на показники ШОЕ у порівнянні з нелікованими тваринами.
Вивчення впливу лікування антибіотиками на загальну кількість лейкоцитів у щурів і морських свинок мало тенденції, аналогічні іншим показникам периферичної крові. Після зараження показник збільшувався – відповідно, на 24,2% і 27,3% для щурів і морських свинок.
Після лікування антибіотиками рівень лейкоцитів знижувався, що свідчить про пригнічення запального процесу. Призначення офлоксацину і рифабутину сприяло приведенню кількості лейкоцитів практично до рівня здорових тварин (відповідно, 104,5% і 103,0% до контролю). Кількість лейкоцитів у групах, пролікованих канаміцином і рифампіцином, виявилася нижчою за контроль, відповідно, на 13,6% і 10,6%.
У лейкоцитарній формулі після зараження тварин спостерігали збільшення кількості еозинофілів, моноцитів і лімфоцитів, а рівень палочкоядерних і сегментоядерних нейтрофілів знижувався або залишався на рівні заражених тварин.
Таким чином, призначення для лікування рифабутину та офлоксацину сприяло поверненню більшості показників периферичної крові до нормального рівня, у той час як канаміцин і рифампіцин сприяли пригніченню клітинного імунітету.