Постановка реакции ПЦР (стр. 2 из 2)
· Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
· Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
· Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.
Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.
Праймеры
Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.
После гибридизации матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.
Амплификатор
ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью "горячего старта", Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.
4. Ход реакции
Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий (рис. 1).
Денатурация
Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.
Отжиг
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).
Элонгация
ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.
Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2n, где n — число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100%, поэтому в действительности P ~ (1+E)n, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла.
Число "длинных" копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.
Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют "эффектом плато".
Рис. 1. Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация. (2) Отжиг. (3) Элонгация. (4) Закончен первый цикл.
5. Анализ ПЦР-амплифицированной ДНК
Для анализа ПЦР-амплифицированной ДНК используют разные методы, наиболее простым из которых является гель-электрофорез.
Материалы
- агароза;
- 0,5-кратный буфер для приготовления агарозного геля;
- ТБЕ-буфер для электрофореза.
Подготовка реагентов
- В колбу объемом 1 литр помещают 1,5 г агарозы, добавляют 150 мл 0,5-кратного буфера ТБЕ. Агарозу нагревают в микроволновой печи до полного расплавления.
- 20 мл концентрированного буфера ТБЕ разбавляют 480 мкл дистиллированной воды, получая буфер для электрофореза.
Оборудование
– прибор для вертикального электрофореза;
– источник питания (источник постоянного тока);
– трансиллюминатор;
– фото- или видеокамера с фильтрами для съемки в УФ;
– автоматические пипетки и наконечники.
Меры предосторожности и правила работы при постановке электрофореза
Реагент бромистый этидий является сильным мутагеном, поэтому все манипуляции проводят с использованием перчаток. Реагенты, содержащие бромистый этидий, перед утилизацией следует подвергать специальной обработке.
Обезвреживание реагентов
Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 M раствора калия перманганата и 1 объем 2,5 M соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4–6 ч. Затем добавляют 1 объем 2,5 M натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.
Постановка
- в специальную ванночку с гребенками вносят расплавленный гель и дают остыть в течение получаса;
- после застывания агарозы гребенки аккуратно достают, стараясь не повредить образовавшиеся лунки, гель смачивают в буфере ТБЕ и помещают на специальную планшету;
- вносят 5 подготовленной пробы в луночки геля;
- гель помещают в ванночку для электрофореза и подключают к источнику тока.
Учет результатов
Учет результатов проводят визуально с помощью трансиллюминатора. При этом агарозный гель достают из кюветы и помещают на стекло трансиллюминатора. Продукты реакции амплификации выглядят в виде светящихся полос, наблюдаемых визуально в УФ-свете трансилляминатора. Результаты фиксируют посредством фотографирования или видеосъемки геля при использовании УФ-фильтров (рис. 2).
Рисунок 2. Фотография геля с продуктами реакции амплификации в УФ-свете трансиллиминатора
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.
ПЦР используют для сравнения так называемых "генетических отпечатков пальцев". Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью гельэлектрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (geneticfingerprint).
ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.
В наше время ПЦР является одним из наиболее высокоточных методов, который используется во многих областях науки и при проведении анализов. Он является большим прорывом в области молекулярной генетики.