Потенциометрический и амперометрический иммуноанализ (стр. 3 из 3)

Н-го и др. разработали вариант гомогенного амперометрического иммуноферментного анализа, основанный на ингибировании антителами превращения апоферментов в холоферменты Модельным определяемым соединением была 2,4-динитрофенила-минокапроновая кислота, а в качестве ферментной метки применяли глюкозооксидазу. Катализируемое последней образование пероксида водорода при окислении глюкозы в присутствии кислорода контролировали амперометрически.

Принцип анализа представлен на рис.7. Определяемое вещество DNP-ACA и DNP-апоглюкозооксидаза конкурируют за данное количество антител против DNP. При добавлении флавинадениндинуклеотида последний может связываться со свободной DNP-CAGO с образованием обладающего ферментативной активностью комплекса DNP-CAGO: FAD, который катализирует образование Н₂0₂ из 0₂ в присутствии глюкозы. Таким образом, скорость образования Н₂0₂ является мерой концентрации свободной DNP-CAGOи, следовательно, концентрации DNP-

АСА в пробе. Концентрацию Н₂0, определяют амперометрически на платиновом электроде при + 700 мВ относительно электрода сравнения Ag/AgCl. Рабочий диапазон анализа равен 2-40 мкг/мл.

Вполне успешно использовавшийся для определения гаптенов гомогенный иммуноферментный анализ значительно реже применяли для определения антител. Недавно описаны такие методики для определения антител к лекарственным препаратам. Цель разработки заключалась в упрощении существующих методик определения антител при сохранении требуемой чувствительности. Метод основан на ингибировании ферментативной активности конъюгата антиген-фермент определяемыми антителами, а в качестве фермента применяли глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу:

Ферментативную активность измеряли амперометрическим определением скорости окисления NADH на платиновом электроде. Возможности методики были продемонстрированы на примере модельной системы лидокаин-антитела к лидокаину, калибровочная кривая которой получена вплоть до ианограммовых количеств антител. Абсолютная чувствительность анализа зависит от начального количества конъюгата антиген-фермент. Показано, что возможное загрязнение платинового электрода, обусловленное адсорбцией белков, и перекрестные реакции антител практически не влияют на результат анализа.

Неферментативные электроактивные метки. Многообещающим направлением в амперометрическом иммуноанализе представляется применение металлсодержащих соединений. К таким меткам предъявляются следующие требования:

1) хорошие электрохимические свойства,

2) нечувствительность к рН в рабочем диапазоне,

3) растворимость в водных средах,

4) отсутствие в биологических жидкостях,

5) устойчивость и в окисленной, и в восстановленной формах.

Одним из первых производных ферроцена в качестве метки для антител был применен 3-карбокси-4-ферроценил-фенилизотиоцианат, выполняющий роль маркера в электронной микроскопии. Каис и др. впервые предложили использовать в иммуноанализе металлсодержащие метки. Они метили низкомолекулярные гаптены в основном металлоорганическими соединениями. В принципе любой металл может реагировать с подходящим органическим лигандом, однако Каис уделил основное внимание соединениям ртути и железа, хотя были получены также гаптены, меченные хромом, медью, палладием, кобальтом, марганцем, платиной и даже золотом. Иммуноанализ с металлоорганическими метками аналогичен РИА. В этом методе необходимо проводить разделение связанной и свободной фракций метки, а содержание металла в каждой фракции можно определить методом атомно-абсорбционной спектроскопии. К сожалению, хотя металлсодержащие метки и менее опасны, чем радиоактивные, методика анализа весьма сложна и требует довольно дорогого аналитического оборудования. Чувствительность анализа сравнима с чувствительностью простейшего гомогенного метода иммуноферментного анализа типа EMIT.

В 1979 г. две группы исследователей опубликовали статьи, в которых были описаны два варианта гомогенного амперометрического иммуноанализа с неферментативными электроактивными метками. Модельными антигенами в обеих работах были небольшие молекулы. Хейнеман и др. в качестве метки для определения эстриола использовали ацетат ртути. Уровень этого гормона в плазме и моче соответствует определенным стадиям беременности. Силу тока, возникающего от метки на ртутном электроде, измеряли с помощью дифференциальной импульсной полярографии. Последующее добавление антител против эстриола приводит к уменьшению пикового тока, обусловленного волной, которая отвечает восстановлению ацетата ртути при - 300 мВ. Связывание конъюгата эстриола с ацетатом ртути и со специфическими антителами предотвращает восстановление метки при - 300 мВ, что устраняет необходимость разделения связанного и свободного меченого антигенов. Добавление немеченого эстриола к раствору, содержащему связанный с антителами конъюгат эстриол - ацетат ртути, приводит к вытеснению меченного металлом гаптена. Степень вытеснения последнего можно контролировать по увеличению тока. Так как восстановление меченного металлом гаптена происходит при потенциале, при котором становится заметным восстановление кислорода, то для устранения побочных реакций необходимо тщательное удаление кислорода из проб.

В другой работе описана методика определения морфина методом гомогенного иммунохимического анализа с производным ферроцена в качестве метки. Коныогат ферроцена с морфином окисляется на стеклоуглеродном электроде при + 500 мВ относительно стандартного каломельного электрода. Добавление антител против морфина приводит к связыванию конъюгата, что сопровождается уменьшением тока окисления. Вытеснение конъюгата из комплекса с антителами при добавлении кодеина приводит к увеличению тока окисления.

Необходимым условием для осуществления гомогенного иммуноанализа такого типа, по-видимому, является различие в коэффициентах диффузии между свободным меченым антигеном и антигеном, связанным с антителами. Следовательно, такие методики могут в общем случае применяться тогда, когда молекула антигена значительно меньше, чем антитело, так как это приводит к большему различию в коэффициентах диффузии между связанным и свободным антигеном.

Металлосодержание метки можно вводить и в высокомолекулярные антигены с их последующим электрохимическим определением. Однако соответствующие методы значительно сложнее методик определения низкомолекулярных соединений. По нескольким а- и ^-аминогруппам сывороточного альбумина человека были введены остатки хелатирующего агента диэтилентриаминпентауксусной кислоты, связывающего ион индия. При физиологических рН прочность комплекса ДТПА с 1п³⁺ Очень велика и его диссоциация наступает только при подкислении раствора. На первый взгляд 1п³⁺ может показаться неудачной меткой, но он имеет то преимущество, что этот металл обычно отсутствует в биологических жидкостях и подвергается характерным обратимым электрохимическим превращениям в комплексообразующих системах. Поэтому анализ можно построить на принципе конкуренции между меченым и нативным антигенами за связывание с определенным ограниченным количеством антител. Связанные с антителами и свободные антигены можно разделить с помощью белка А из Staphylococcusaureus. Ион In³⁺ затем выделяют из связанной. фракции путем подкисления раствора и определяют методом дифференциальной импульсной анодной вольтамперометрии. Последний определяет чувствительность всего анализа, которая должна быть настолько высокой, что определение концентраций на уровне нмоль/л не должно представлять никаких затруднений. В варианте сандвич-анализа, в котором первые антитела связаны с твердой фазой, а вторые антитела помечены металлом, можно еще более упростить анализ и повысить его чувствительность.

В первых работах с применением меченных ферроценом гаптенов была достигнута лишь ограниченная чувствительность. Сообщение Касса и др. о том, что ферроцен и его производные могут выполнять роль переносчика электронов между электродом и глюкозооксидазой _v, оживило интерес к применению этой метки в гомогенном иммуноанализе. Показано, что при восстановлении флавина глюкозооксидазой в присутствии глюкозы окисленную форму фермента можно регенерировать путем переноса электронов на феррициний-ион, образующийся на электроде. Такая система не зависит от присутствия кислорода, так как феррициний-ион становится как бы вторым кофактором глюкозооксидазы: лидокаина.

Соответствующая методика включает использование конъюгата лидокаина с ферроценом, который в окисленной форме служит акцептором электронов для глюкозооксидазы. При связывании конъюгата со специфическими антителами способность переносить электроны утрачивается. Добавление свободного лидокаина приводит к вытеснению некоторого количества конъюгата из комплекса с антителами и таким путем к уменьшению ингибирования. Соответствующее изменение силы тока отражает количество присутствующего лидокаина. Разработаны аналогичные методики гомогенного электрохимического иммуноанализа для определения теофиллина и тироксина.

Заключение

Электрохимический иммуноанализ должен найти применение в медицине и ветеринарии, а также и в других областях, например в пищевой промышленности или на водоочистных сооружениях. Сочетание селективности взаимодействия антиген-антитело с низким пределом обнаружения современных электрохимических методов привело к созданию эффективных аналитических методик, которые лишены многих недостатков, свойственных спектроскопическим методам.

Амперометрический иммуноанализ представляется более перспективным, чем потенциометрический, поскольку пока что не найдена идеальная поляризованная мембрана, необходимая для создания действительно иммунохимически селективного потенциометрического электрода или транзистора. Однако любая методика иммуноанализа должна быть надежной, быстрой, простой и дешевой для того," чтобы она смогла реально конкурировать с хорошо отработанными и широко применяемыми методами иммуноанализа.