Практикум по энзимологии (стр. 2 из 6)
а =
Содержание отчета
1. Рассчитайте активность фермента в исследуемом материале.
2. Опишите фермент и его предполагаемую биологическую роль. Напишите предполагаемый систематический код фермента.
Работа 4. Определение кинетических параметров реакции гидролиза трипсином бензоил-аргинин-пара-нитроанилида методами Лайнуйвера-Бэрка и Эйзенталя-Корниш-Боудена. Определение типа ингибирования трипсина высокомолекулярным ингибитором трипсина из бычьего легкого
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, растворы БАПНА следующих концентраций: 1 мМ, 0,75 мМ, 0,5 мМ, 0,25 мМ, 0,125 мМ, раствор трипсина (10 мкг/мл), раствор ингибитора трипсина* (10 мкг/мл), 1 н HCl.
* Приготовление раствора ингибитора: 1 мг ингибитора растворяют в 1 мл 0,0025 н HCl. Рабочий раствор готовят непосредственно перед опытом путем стократного разведения исходного раствора дистиллированной водой.
Для определения Vmaxи Км данной реакции, а также типа ингибирования трипсина строят график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата без ингибитора и в присутствии ингибитора (в системах координат Лайнуйвера-Берка и Эйзенталя-Корниш-Боудена). Для каждой концентрации субстрата выставляют по 4 пробирки: 2 опытных и 2 контрольных. Схема определения активности трипсина.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37 °С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37 °С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Активность фермента в присутствии ингибитора определяют по схеме.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| 100 мкл раствора ингибитора трипсина (10 мкг/мл) | 100 мкл буфера |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37°С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37°С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Графики зависимости строят на миллиметровой бумаге.
Содержание отчета
1. Рассчитайте кинетические параметры и определите тип ингибирования способом Лайнуйвера-Бэрка.
2. Рассчитайте кинетические параметры и определите тип ингибирования способом Эйзенталя и Корниш-Боудена.
Работа 5. Изучение влияние температуры и рН среды на активность трипсина
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, две водяные бани, 1 мМ растворы БАПНА в 0,05 М фосфатном буфере со следующими значениями рН: 9, 7.6, 6, 5, раствор трипсина (10 мкг/мл), 1 н HCl.
1. Для изучения влияния рН среды на активность трипсина пользуются растворами БАПНА с разными значениями рН, по 2 опыта и 2 контроля в каждой параллели. Активность определяют по схеме.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37 °С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37 °С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Строят график зависимости активности трипсина от рН среды.
2. Для изучения влияния температуры среды на активность трипсина пользуются этой же схемой, используя раствор БАПНА со значением рН=7,6, но пробирки инкубируют:
а) при комнатной температуре;
б) при 4 °С (Инкубировать в холодильнике. Использовать предварительно охлажденные растворы!);
в) на водяной бане при t=55 °С;
г) на водяной бане при t=75 °С.
Содержание отчета
1. График зависимости активности трипсина от рН среды.
2. График зависимости активности трипсина от температуры.
Работа 6. Определение константы ингибирования трипсина высокомолекулярным ингибитором трипсина из бычьего легкого методом Диксона
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, 1 мМ раствор БАПНА, раствор трипсина (10 мкг/мл), растворы ингибитора трипсина следующих концентраций:10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1 мкг/мл*, 1 н HCl.
* Приготовление растворов ингибитора: 1 мг ингибитора растворяют в 1 мл 0,0025 н HCl. Получают маточный раствор с концентрацией 1 мг/мл. Рабочие растворы готовят непосредственно перед опытом путем разведения маточного раствора в необходимом соотношении дистиллированной водой.
Определяют активность трипсина при различных концентрациях субстрата и ингибитора. Для каждой концентрации ингибитора выставляют по 4 пробирки: 2 опытных и 2 контрольных. Схема определения активности трипсина.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| 100 мкл раствора ингибитора трипсина | 100 мкл буфера |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37 °С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37 °С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Графики зависимости обратной скорости от концентрации ингибитора и зависимости s/vот концентрации ингибитора строят на миллиметровой бумаге.
Содержание отчета
1. Определите константу ингибирования методом Диксона.
Работа 7. Частичная очистка ФМСФ-КП из печени крыс фракционированием сульфатом аммония
Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, стеклянные стаканы на 50 и 100 мл, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl(рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR), 1 н HCl, хлороформ, кристаллический сульфат аммония, набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.
4 г печени животного гомогенизируют на льду в 20 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 200 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 3,8 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.
Все дальнейшие операции производят на льду. Измеряют объем оставшегося центрифугированного гомогената. Добавляют кристаллический сульфат аммония до достижения 10 % концентрации и тщательно перемешивают. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течении 10 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают и измеряют объем. К осадку добавляют исходный буфер до полного растворения, затем разводят этим же буфером в 10 раз и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка.
К надосадочной жидкости добавляют кристаллический сульфат аммония до достижения 20 % концентрации, центрифугируют, отделяют осадок, растворяют его в буфере, разводят в два раза буфером и помещают на лед. Повторяют операцию по высаливанию, добавляя сульфат аммония к надосадочной жидкости до достижения 60 % концентрации. Осадок, отделенный центрифугированием ресуспендируют в исходном буфере и разбавляют в десять раз. Во всех фракциях, гомогенате и конечном супернатанте определяют активность по следующей схеме.
| Опыт ( – ) | Контроль ( + ) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогената | 50 мкл гомогената |
| – | 10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой) |
| Преинкубация 8 минут при 37°С | |
| 50 мкл раствора DNS-FLR | 50 мкл раствора DNS-FLR |
| Инкубация 30 мин при 37°С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех=360 нм, λем=530 нм). Количество белка в пробе определяют методом Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб, не содержащих ФМСФ, и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а =
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.
| Фракция | Гомогенат | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% | 60% |
| Активность | |||||||
| Степеньочистки | 100% |
Работа 8. Частичная очистка ФМСФ-КП из печени крыс методом гель-фильтрации
Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, стеклянные стаканы на 50 и 100 мл, колонка для гель-фильтрации высотой 15 см, шприц, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl(рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR), 1 н HCl, хлороформ, сефадекс G‑75,0,9% раствор NaCl, набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.