Практикум по энзимологии (стр. 4 из 6)
Открывают зажим колонки и сливают столбик буфера, находящийся над гелем. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя. Затем заполняют колонку раствором 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH6,0, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. Для удаления несвязавшихся белков колонку промывают 50 мл буфера.
Затем фермент элюируют 1 М натрий-ацетатным буфером с 0,05 М NaCl, pH3,7. С момента этого буфера на колонку собирают 12 фракций объемом 2 мл.
Во 2, 4, 5, 6, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.
| Опыт ( – ) | Контроль ( + ) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогената | 50 мкл гомогената |
| – | 10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой) |
| Преинкубация 8 минут при 37°С | |
| 50 мкл раствора DNS-FLR | 50 мкл раствора DNS-FLR |
| Инкубация 30 мин при 37°С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробирки помещают в центрифуги и центрифугируют их 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех=360 нм, λем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб, не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а =
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.
| Фракция | Гомогенат | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 |
| Активность | |||||||
| Степеньочистки | 100% |
| Фракция | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 | 22 | 24 |
| Активность | |||||||
| Степеньочистки |
Работа 11. Изучение субклеточного распределения ДНКазы (фермента-маркера ядерной фракции) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга с охлаждением; ФЭК; гомогенизатор; печень животного; пипетки; ДНК; 0,1 М NaOH; 0,01% раствор крезолового красного; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2OрН 5,0 (среда Б); набор растворов для определения белка по Лоури.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по следующей схеме.
Ресуспендирование проводят гомогенизированием полученных осадков в 4-6 мл среды гомогенизации (б), затем полученную суспензию переносят количественно в мерный цилиндр на 20 мл и объем суспензии доводят до 18 мл; таким образом, концентрация субклеточных структур достигает исходной (как в гомогенате) концентрации.
Активность ДНКазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
| 1 мл раствора ДНК (1 мг/мл) |
| 1 мл 0,01% раствора крезолового красного |
| 1 мл буфера А |
| Преинкубация 8 минут при 37 °С |
| 1 мл нагретого раствора фракции |
Смесь быстро переливают в фотометрическую кювету (L=1 см) и измеряют оптическую плотность на ФЭК при 590 нм против буфера А. После измерения смесь немедленно переливают в исходную пробирку и инкубируют 20 мин при 37°С. Измеряют оптическую плотность системы после инкубации. Количество белка определяют по Лоури.
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
| Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С | ||||||
| Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
| Оптическая плотность,в каждой параллели и среднее | ||||||||||||
| Аоп – Акн | ||||||||||||
| Активность на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Активность фракции в % от гомогената | 100 % | |||||||||||
| Количество белка на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Белок в % от белка гомогената | 100 % | |||||||||||
| Относительная удельная активность фракций | ||||||||||||
Работа 12. Изучение субклеточного распределения кислых протеаз (ферментов-маркеров лизосом) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0,32 М сахарозы, рН 7,55; 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 3,3; 8% раствор гемоглобина; 5% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); тирозин кристаллический; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2OрН 5,0 (среда Б).
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность кислых протеаз определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
| опыт | контроль |
| 200 мкл фракции | 200 мкл фракции |
| 600 мкл NaAc буфера, рН 3,3 | 800 мкл NaAc буфера, рН 3,3 |
| Преинкубация 8 минут при 37°С | |
| 200 мкл 8% раствора гемоглобина | – |
| Инкубация 40 минут при 37°С | |
| 1 мл 5 % ТХУ | 1 мл 5 % ТХУ |
Пробы центрифугируют 30 мин при 4000 об/мин. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и определяют количество образовавшегося тирозина спектрофотометрически при 280 нм. Количество белка в супернатанте определяют спектрофотометрически при 280 нм. Активность фермента определяют по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика
Готовят рабочий раствор тирозина с концентрацией 100 мкг/мл. Затем производят его разведение в соответствии со схемой.
| № пробирки | Vр-ра тир | Vр-ра воды | Конц, мкг/мл | Dср |
| 1 | 0,5 | 4,5 | ||
| 2 | 1 | 4 | ||
| 3 | 1,5 | 3,5 | ||
| 4 | 2,0 | 3 | ||
| 5 | 2,5 | 2,5 | ||
| 6 | 3,0 | 2,0 | ||
| 7 | 3,5 | 1,5 | ||
| 8 | 4,0 | 1,0 | ||
| 9 | 4,5 | 0,5 | ||
| 10 | 5,0 | 0,0 |
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
| Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С | ||||||
| Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
| Оптическая плотность,в каждой параллели и среднее | ||||||||||||
| Аоп – Акн | ||||||||||||
| Количество тирозина по калибровочной кривой | ||||||||||||
| Активность на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Активность фракции в % от гомогената | 100% | |||||||||||
| Количество белка на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Белок в % от белка гомогената | 100% | |||||||||||
| Относительная удельная активность фракций | ||||||||||||
Работа 13. Изучение субклеточного распределения сукцинатдегидрогеназы (маркера митохондрий) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; 0,5 М раствор сукцината натрия в субстратном буфере; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2OрН 5,0 (среда Б); 0,02 М раствор феназинметасульфата*; 0,001 М раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ)**.
* Приготовление раствора феназинметасульфата. 12 мг вещества переносят в стеклянную пробирку, добавляют 2 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой и перемешивают. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
** Приготовление раствора ДХФИФ. 17 мг вещества растворяют в колбе на 50 мл. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность сукцинатдегидрогеназы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по одной из следующих схем:
а) кинетическая схема определения активности.
| опыт | контроль |
| 400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера |
| 200 мкл сукцината натрияна субстратном буфере | – |
| 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата |
| 200 мкл 0,001 М ДХФИФНЕПОСРЕДСТВЕННОПЕРЕД ОПЫТОМ | 200 мкл 0,001 М ДХФИФНЕПОСРЕДСТВЕННОПЕРЕД ОПЫТОМ |
| Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С | |
| 3 мл фракции,НАГРЕТОЙ ДО 37 °С | 3 мл фракции,НАГРЕТОЙ ДО 37 °С |
Смесь быстро перемешивают и немедленно переливают в кювету (l= 1 см), на секундомере отмечают время начала реакции. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм каждые 20 сек в течении 3 мин. Аналогичным образом измеряют снижение оптической плотности в контрольных пробах, не содержащих сукцината. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.