Содержание отчета
1. Запишите результаты определений мочевины в крови.
Работа 17. Иммуноферментное определение тестостерона в сыворотке крови
Оборудование и реактивы: сыворотка крови человека, автоматическая пипетка с наконечниками, набор стандартных растворов тестостерона с известными концентрациями, иммуноферментный коньюгат, субстратный раствор, стоп-раствор, стрипы с иммобилизованными моноклональными антителами к тестостерону, инкубатор для планшет, вошер для планшет, иммуноферментный ридер планшет.
Тест-система ИФА для определения тестостерона основана на принципе конкурентного связывания. Лунки микротитра покрыты антителом к уникальному антигенному сайту на молекуле тестостерона. Эндогенный тестостерон в пробе конкурирует с конъюгатом тестостерона и пероксидазы хрена за связывание с антителом, которое сорбировано на микропанелях. После инкубации несвязавшийся конъюгат смывается. Количество связавшегося конъюгата обратно пропорционально концентрации тестостерона в образце. При добавлении субстратного раствора интенсивность полученного окрашивания обратно пропорциональна концентрации тестостерона в сыворотке.
Общие замечания к проведению анализа
− Все пробы и реагенты перед проведением анализа должны быть доведены до комнатной температуры. Смешивание реагентов надо осуществлять, избегая вспенивания.
− После начала проведения теста следует осуществлять все этапы последовательно без прерывания.
− Для каждого реагента используйте новые чистые пластиковые наконечники микропипеток для исключения перекрестной контаминации. Для раскапывания субстрата и останавливающего раствора не следует использовать пипетки с металлическими частями.
− Вносите стандарты и пробы в нижнюю часть лунки с помощью микропипетки. Что касается внесения Иммуноферментного Конъюгата и Стоп-раствора, рекомендуется держать пипетку вертикально и направлять падающую каплю строго в центр лунки для осуществления полного перемешивания указанных компонентов.
− Перед постановкой теста рекомендуется подготовить все реагенты, снять крышки, закрепить в держателе необходимое количество полосок с лунками. Это обеспечит равные затраты времени на все необходимые этапы ИФА и предотвратит задержки пипетирования.
− В целом ферментативная реакция обычно линейно пропорциональна времени проведения и температуре. Это делает возможной интерполяцию для физико-химических условий реакции. В частности, если величина абсорбции нулевого стандарта ниже 1,0 или же превышает верхний уровень возможного измерения для используемого ридера, можно изменить время инкубации с субстратом до 30 мин, или же до 10 мин, соответственно этим наблюдениям.
− Поскольку калибрующие стандарты проставляются в каждом тесте, флюктуации абсолютных величин абсорбции не отражаются на конечном результате ИФА.
− Раствор субстрата перед использованием должен быть бесцветным или иметь чуть различимый голубовато-зеленоватый оттенок. Наличие выраженного голубого окрашивания указывает на непригодность субстрата. Его следует заменить!
− Во время инкубации с Субстратом следует защитить микротитровальные панели от света.
ЗАБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ ДЛЯ АНАЛИЗА
1. Для исследования надо использовать сыворотки, или же плазму после обработки EDTA. Не требуется какой-либо дополнительной подготовки проб. Пробы для анализа можно хранить при 2 – 8 °С до 5 дней, при необходимости более длительного хранения пробы необходимо замораживать и хранить при – 20 °С или более низкой температуре. Не используйте пробы с выраженным гемолизом или с повышенным содержанием липидов.
2. Пробы, содержание тестостерона в которых предположительно превышает 16 нг/мл, следует разводить с использованием нулевого стандарта.
3. Если при первой постановке образец сыворотки показал концентрацию больше, чем высший стандарт, то образец должен быть разведен в 10 или в 100 раз нулевым стандартом и проанализирован снова. При подсчете должен приниматься во внимание фактор пересчета.
ВНИМАНИЕ! В данном тесте нельзя использовать пробы, содержащие азид натрия.
1. Закрепите желаемое количество полосок с подготовленными лунками в держателе.
2. Внесите по 25 мкл стандартов тестостерона и проб в соответствующие лунки.
3. Внесите 200 мкл иммуноферментного конъюгата в каждую лунку.
4. В течение 10 сек. смешивайте реагенты в панели. На этом этапе чрезвычайно важно добиться полного смешивания реагентов.
5. Не закрывая панель, инкубируйте при комнатной температуре 60 мин.
6. Освободите лунки от содержимого (например выплеснув и постучав по фильтровальной бумаге). Трижды промойте лунки раствором для промывки (по 400 мкл в лунку). Тщательно “выбейте” остатки жидкости на фильтровальной бумаге. Операцию № 6 рекомендуется осуществлять в автоматическом режиме, используя автоматический вошер для планшет.
7. Внесите 200 мкл энзим-субстрата в каждую лунку с равными временными интервалами.
8. Инкубация 15 мин при комнатной температуре.
9. Остановите реакцию добавлением в каждую лунку 100 мкл стоп-раствора с такими же временными интервалами, как на этапе 7.
10. Измерьте оптическую плотность в лунках при длине волны 450 + 10 нм в течение 10 мин после добавления стоп-раствора
Содержание отчета
1. Определите значение абсорбции для стандартов и образцов.
| Конц. стандартов, нг/мл |
| Величина абс., D |
2. Используя любую миллиметровую или логарифмическую сетчатую бумагу, постройте стандартную кривую, нанося значения абсорбции (Y) Стандартов против их концентрации (Х) в нг/мл.
3. Используйте среднюю величину абсорбции каждой пробы для интерполяции концентрации Тестостерона путем простого наложения данных на указанную кривую.
Запишите концентрацию тестостерона в сыворотке крови.
ПРИМЕЧАНИЯ
1. Работы № 11 – № 14 выполняются каждая в течении одного дня, так как ферменты-маркеры субклеточных фракций инактивируются при замораживании-оттаивании. В случае нехватки времени на выполнение полной схемы работы выполняются в следующем варианте:
- активность ферментов-маркеров определяется в свежеприготовленном 1% гомогенате. 100 мг печени гомогенизируется в 1,9 мл рабочего буфера (в работе № 11 - 0,01 М трис-буфер рН 7,4; в работе № 12 - 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 3,3; в работе № 13 - буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; в работе № 14 - 0,1 М цитратный буфер рН 6,5). Затем гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок.
2. Определение белка по Лоури. Необходимые реактивы: реактив Фолина, реактив А, реактив В.
Реактив А. 0,5 г CuSO4·5H2O+ 1 г цитрата Naна 100 мл воды, хранить в морозильнике. Для использования разморозить небольшую часть и хранить в холодильнике.
Реактив В. 4 г NaOH+ 54 г Na2CO3·10H2O(или 20 г Na2CO3) на литр воды.
Реактив С. 50 мл В + 1 мл А. Готовить непосредственно перед определением концентрации белка.
Для определения концентрации в три пробирки наливают по 0,5 мл разведенного раствора белка, в каждую из трех пробирок и в контроль (0,5 мл дист. воды) приливают по 1 мл реактива С, перемешивают и выдерживают 10 мин при комнатной температуре. Затем приливают по 0,1 мл реактива Фолина и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Можно больше. Все пипетки сразу промыть дистиллированной водой. Измеряют светопоглощение на ФЭК при λ=750 нм в кювете толщиной 1 см против контроля.
Библиографический список
1. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. - М.: Наука, 1986. – 332 с.
2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. - М.: Мир, 1982. - Т. 1 – 3.
3. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. - М.: Мир,
1980. – 432 с.
4. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. – М.: Мир, 1986. – 374 с.
5. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высш. школа, 1980. – 272 с.
6. Практикум по биохимии/ под ред. С.Е. Северина и Г.А. Соловьёвой.
– М.: МГУ, 1989. – 509 с.
7. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. – М.: Наука, 1978. – 248 с.
8. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир,
1979. – 280 с.
9. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. – М.: Мир, 1983. – 293 с.
10. Бернхард С. Структура и функция ферментов. – М.: Мир, 1971. – 334 с.
ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ ИМ. В. Г. БЕЛИНСКОГО
В. Б. Соловьев, М. Т. Генгин
Практикум по энзимологии
Учебно-методическое пособие
Редактор – Л. И. Дорошина
Корректор – Е. С. Моисеева
Оригинал-макет – В. Б. Соловьев
Поз. 157
Подписано к печати 07.12.07 Формат 60 × 84 / 16
Бумага писчая белая Печать офсетная
Усл. – печ. л. 3,0 Уч. – изд. л. 3,2
Тираж экз. 100 Заказ № 175 / 07 Цена С. 183
Редакционно-издательский отдел ПГПУ им. В. Г. Белинского:
440026, Пенза, ул. Лермонтова, 37,
Педагогический университет, корпус 5, комната 466
Отпечатано с готового оригинал-макета в мини-типографии
ООО КФ «Партнер-ДелКон»:
г. Пенза, ул. Богданова, 2а,
тел. 52-58-60, 52-58-61
E-mail: p-audit@p-audit.ru, www.p-audit.ru