Применение иммуноанализа в ветеринарии (стр. 2 из 3)
Для обнаружения вирусных или бактериальных антигенов традиционно используют двухсайтовые методы ИФА типа ELISA, тогда как для определения уровня циркулирующих антител против компонентов инфекционных агентов применяют непрямые методы ИФА типа ELISA. Схематически двухсайтовый и непрямой методы ИФА типа ELISA представлены на рис. 4а и 4б. В последнее время по экономическим соображениям стали отказываться от методов ИФА на микротитровальных планшетах. Примером может служить новый и более удобный для потребителя набор ImmunpcombSystem, разработанный и выпускаемый фирмой Orgenics и основанный на непрямом методе ИФА типа ELISA.
Таблица 2. Наиболее распространенные инфекционные заболевания, которые можно диагностировать с помощью имеющихся в продаже иммунодиагностических наборов
| Животные Инфекционное Методзаболевание | Фирма-производитель | ||
| Коровы | Респираторный | 1 | Boots-Celltech (Великобритания) |
| синцитиальный вирус | |||
| Инфекционный ринотрахеит | 2 | Flow Laboratories (Великобритания) | |
| Лейкоз | Hoechst (ФРГ) | ||
| ЭнтеритE.coli | 4 | Molecular Genetics (США) | |
| Свиньи | Болезнь Ауески | 2 | Flow Laboratories (Великобритания) |
| 5 | Viral antigens (США) | ||
| Лошади | Стронгилоидная инфекция | 5 | Cambridge Vet. Sci. (Великобритания) |
| Собаки | Глисты(Dirafilaria immitis) | 6 | Allelix (Канада) |
| Парвовирус | 7 | Greenbriar Veterinary Services (США) | |
| Парвовирус | 6 | Hoechst (Великобритания) | |
| Кошки | Вирус лейкемии | 6 | Pitman-Moore (США) |
| Инфекционный перитонит | 1 | Daryl Lab. (США) | |
| Птицы | Ньюкаслская болезнь | Agritech Sys. (США) | |
| Инфекционная болезнь | |||
| синовиальной сумки | |||
| Ретровирус | |||
| инфекционного бронхита | 2 | Dynatech Lab. (Великобритания) | |
| Микоплазмоз | |||
| Пастереллез | |||
| Сальмонеллез | |||
| Вирус ретикулеза | |||
Набор Immunocomb предназначен для диагностики ньюкасл-ской болезни птиц; в нем используется пластиковая гребенка с зубцами, на которых адсорбирован антиген. Пробу добавляют в соответствующие лунки специальной кассеты; в лунки вставляют и зубцы гребенки. После первичной инкубации гребенку переносят в промывающее устройство и затем в раствор, содержащий конъюгат антииммуноглобулинов с ферментом. После повторной промывки гребенку переносят в раствор субстрата, образующего нерастворимый окрашенный продукт. Такая последовательность: 1 – иммунофлуоресценция; 2 – непрямой ИФА типа ELISA для определения антител; 3 – иммуиодиффузия; 4 – ИФА на дипстиках; 5 – латексная агглютинация; 6 – двухсайтовый ИФА для определения антигена; 7 – гемагглютинация.
Операции позволяет одновременно проводить анализ и получать калибровочную кривую. Другим примером усовершенствования набора может служить применение полимерной палочки с иммобилизованными антителами, так – называемого гаммастика. Гаммастик входит в набор Coli-Test 99 EIA, который разработала и выпускает фирма MolecularGeneticsInc. для обнаружения Escherichiacoli, являющейся главной причиной воспаления* тонкой кишки у телят. Конструкция гаммастика позволяет увеличивать количество антител, которые можно иммобилизовать на твердой фазе, и отношение площади поверхности реагентов к объему реакционной смеси, а тем самым ускорить анализ. Применение высокоаффинных антител против фимбриального антигена адгезии К99 также способствует ускорению анализа. Гаммастик существенно облегчает постановку анализа одной пробы.
Однако в большинстве случаев количество анализируемых проб велико, что ограничивает применимость гаммастика. Напротив, микротитровальные планшеты идеально подходят для выполнения большого числа анализов. Методика выполнения анализа на планшетах традиционна, хотя для измерения результатов анализа в последнее время выпускают более совершенные приборы. Примером может служить прибор CLSMicroplatereader, разработанный и выпускаемый фирмой CambridgeLifeSciencespic и представляющий собой очень компактный спектрофотометр. Компактность достигнута, в частности, за счет применения миниатюрных аккумуляторов в качестве источников питания. Такой прибор позволяет осуществлять анализы типа ИФА вне центральной лаборатории и быстрее получать результаты. Эти факторы могут стать решающими при выборе метода мониторинга некоторых инфекционных болезней.
3. Определение токсинов и остаточных количеств чужеродных веществ
Большую озабоченность медиков и широкой общественности вызывают 1) загрязнение пищи анаболическими гормонами, например диэтилстильбэстролом; 2) проникновение в молочные и мясные продукты антибиотиков, например пенициллина и хлорамфеникола; 3) применение наркотических средств для стимулирования спортивных результатов животных, например скаковых лошадей и борзых собак; 4) загрязнение пищи и кормов микотоксинами. Так как разрабатываемые в настоящее время методы скрининга в равной степени применимы для любого из перечисленных выше гаптенов, то в качестве примера ниже детальнее будут рассмотрены успехи в обнаружении и определении одного из микотоксинов – афлатоксина.
3.1 Афлатоксины
С1986 г. изучению проблемы загрязнения пищи афлатоксинами уделяется очень много внимания в средствах массовой информации. Афлатоксины – это группа грибковых токсинов, продуцируемых распространенными во всем мире Aspergillusflavusи Aspergillusparasiticus. Афлатоксины могут загрязнять кукурузу, семена хлопчатника, зерновые культуры, рис, арахис и другие орехи. Афлатоксины образуются при высокой влажности и повышенной температуре. Чаще всего загрязнение микотоксинами происходит в тропиках во время хранения урожая после его уборки.
Афлатоксины были открыты в 1961 г. при изучении причин внезапной вспышки инфекции и последующей гибели нескольких тысяч птиц на ферме по разведению индеек в Норфолке. Довольно быстро было установлено, что гибель птиц произошла из-за заражения кормов. В результате удалось идентифицировать афлатоксины, из которых наиболее важен афлатоксин Bi. Позднее было собрано большое количество экспериментальных данных по воздействию афлатоксинов на лабораторных животных. В смесях афлатоксинов обычно доминирует афлатоксин Bi; он очень токсичен и вызывает разрушение печени за счет эффективной инфильтрации жиров в клетки печени. Показано, что он также в чрезвычайно малых концентрациях вызывает рак печени по меньшей мере у 8 родов животных, включая крыс, радужную форель и приматов.
Особое внимание в настоящее время уделяется разработке быстрых тестов для скрининга проб на афлатоксины, причем чувствительность теста в соответствии с действующим законодательством Великобритании должна составлять не более 10 мкг/кг для афлатоксина Bj в орехах и продуктах из них. Часто забывают о том, что определению афлатоксинов и других токсинов должно предшествовать их выделение путем экстракции. Это требование справедливо по отношению как к иммуноанализу, так и к более классическим аналитическим методам – тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Необходимость операции экстракции определяемого вещества затрудняет разработку соответствуй ющей методики анализа продуктов на месте их хранения. Однако пока продолжаются поиски быстрого и простого метода экстракции, очень эффективные и действительно остроумные иммунохимические наборы для определения афлатоксина Bt уже появляются в продаже. Так, фирмой EnvironmentaldiagnosticsInc. для определения афлатоксина Вх разработан и производится набор EZ-Screen.
Рабочим элементом этого набора является стекловолоконная мембрана. Сначала антитела против афлатоксина Вг иммобилизуют на мелкозернистом материале и затем этот комплекс смешивают со стекловолокном. Мелкозернистые частички с иммобилизованными антителами прочно удерживаются стекловолокном, и антитела не смываются с твердой фазы. Затем добавляют экстракт, содержащий афлатоксин, вслед за тем – афлатоксин, меченный пероксидазой хрена. Затем, опять-таки без стадии промывки, добавляют субстрат 4-хлор-1-нафтол. В тех зонах мембраны, где уровень афлатоксина Bj не превышает 5 мкг/кг, образуется нерастворимый пурпурный продукт. Схематически эта методика представлена на рис. 7. Анализ выполняется менее чем за 5 мин. Быстрота определения связана с большой площадью поверхности стекловолоконной матрицы, на которой осуществляется иммунохимическая реакция. Кроме того, стекловолокно легко пропускает избыток реагентов в сливной контейнер, поэтому здесь не требуется стадия промывки. Этот пример еще раз показывает, что принципы иммуноанализа в сочетании с оригинальной методикой и аппаратурой позволяют резко ускорить анализ при сохранении необходимой чувствительности. Простота описанного набора делает его идеальным для анализа пищевых продуктов и кормов на месте их хранения.