Применение иммуноанализа в ветеринарии (стр. 1 из 3)
Применение иммуноанализа в ветеринарии
Введение
В настоящее время иммуноанализ только начинают применять в ветеринарии, однако успехи иммунодиагностики человека являются надежным базисом для развития и этой области. Сейчас разрабатываются новые методы иммуноанализа; можно надеяться что люминесцентные системы определения в конце концов вытеснят более обычные в настоящее время методы радиоиммуноанализа и иммунорадиометрического анализа. В настоящий момент основные усилия направлены на разработку быстрых методов анализа, позволяющих поставить диагноз на месте пробы. Ясно, что иммуноферментный анализ и иммуноанализ на частицах лучше отвечает этим целям, так как они позволяют интерпретировать результате визуально. В этой связи понятно, почему сейчас поступает в продажу большое число наборов, в которых используются методу ИФА и латексной агглютинации. Здесь оказываются полезными же технические новшества, что и в диагностике заболеваний человека, когда требуются быстрые и дешевые тесты для контражизненноважных ситуаций и лечения.
Существуют три основные сферы применения иммунодиагностики на базе ИФА и агглютинации в ветеринарии: 1) оценка фертильности; 2) диагностика инфекционных заболеваний; 3) обнаружение токсинов и остаточных количеств различных веществ.
Иммунодиагностика приобретает большое значение и в других сферах ветеринарии, перечисленных в табл. 1. Преимущества иммунодиагностики и наиболее интересные методики будут рассмотрены ниже. Развитие иммунодиагностики в ветеринарии обусловлено рядом причин: 1) ростом рынка сбыта соответствующих наборов; 2) немногочисленностью правовых барьеров; 3) простоте; и доступностью методик.
Таблица 1. Возможные сферы применения иммуноанализа в ветеринарии
| Область применения | Примеры | Принцип анализа |
| Обнаружение следовых | ||
| количестве шести: | ||
| - в мясных тушах | Эстрогены | ИФА |
| - антибиотиков в молоке | Пенициллин | ИФА |
| Анализ продуктов питания: | ||
| - токсины | Афлатоксин | ИФА |
| Диагностика заболеваний: | ||
| • сельскохозяйственные животные | Ротавирус | Двухсайтовын ИФА |
| - домашние животные | Вирус Corona | Непрямой ИФА |
| Латексная агглютинация | ||
| Иммунный статус: | ||
| - сельскохозяйственные животные | IgG | Латексная агглютинация |
| Фертильность: | ||
| - сельскохозяйственные животные | Прогестерон | ИФА |
| - домашние животные | Сульфат эстрона |
Основными потребителями иммунодиагностических наборов будут, очевидно, специализированные лаборатории, ветеринарии лечебницы и владельцы скота; в последнем случае анализы будут выполнять сам фермер или ветеринар непосредственно на месте содержания животных. Очевидно, что методика анализа определяется предполагаемым потребителем. Например, набор для анализа в полевых условиях должен быть полностью укомплектован готовыми к применению реагентами; еще важнее, чтобы методика была простой и непродолжительной по времени выполнения. Стоимость каждого полевого набора будет зависеть от спроса, и понятно, что наборы для анализов в полевых условиях будут относительно недорогими. Напротив, цена наборов для немногочисленных лабораторных анализов будет более высокой. Место выполнения анализа определяет и максимальное время его выполнения. Так, лабораторные анализы могут выполняться в течение нескольких часов, а идеальный анализ в полевых условиях должен отнимать несколько минут.
1. Оценка фертильности
В ветеринарии внимание фирм, производящих иммунодиагностические наборы, и академических исследователей прежде всего привлекла диагностика фертильности или фекундильности. Хотя это и не столь очевидно, отсутствие контроля фертильности крупного рогатого скота может нанести фермеру большой экономический ущерб. Следовательно, быстрая и надежная оценка фертильности животных должна дать значительный экономический эффект. В настоящее время наиболее полезными показателями репродуктивного статуса являются изменения концентраций различных гормонов или их метаболитов.
1.1 Прогестерон
Для оценки фертильности в полевых условиях наиболее типична проблема отбора проб. Соответствующий химический маркер должен находиться в легкодоступной жидкости, которая требует лишь минимальной предварительной обработки или вообще не нуждается в ней. В настоящее время для контроля репродуктивного цикла коров чаще всего используют прогестерон. Концентрация последнего в периферической системе кровообращения животных относительно низка во время овуляции, затем постепенно возрастает до максимума. Между 17 и 20 днями после последней течки количество прогестерона в плазме быстро падает, что указывает на начало следующего цикла созревания яйцеклетки. Типичные изменения концентрации прогестерона в плазме коров представлены на рис. 1. Если животное становится стельным, то высокая концентрация гормона сохраняется.
Оказалось, что концентрация прогестерона в периферической системе кровообращения и в молоке коров изменяется параллельно; следовательно, отбор проб крови и последующее выделение сыворотки или плазмы не обязательны. Зауэр и др. впервые разработали методику типа ИФА для определения прогестерона в коровьем молоке. В этой методике использовались иммобилизованные на твердой фазе антитела и конъюгат прогестерона. На базе этого метода разработан иммунохимический набор для определения фертильности крупного рогатого скота в полевых условиях.
Фирмой CambridgeVeterinarySciencesразработан и налажен промышленный выпуск надежного, полностью укомплектованного набора реагентов OvucheckCowside™, предназначенного для определения уровня прогестерона в коровьем молоке на месте отбора проб. В этом наборе используются микротитровальные полоски с предварительно адсорбированными в их лунках моноклональными антителами к прогестерону. Анализ выполняется менее чем за 45 мин. Потребителю необходимо только добавить определенное количество пробы или стандарта в соответствующее число используемых лунок. Затем в лунки с помощью капельницы добавляют конъюгат прогестерона с щелочной фосфатазой. Содержимое лунок осторожно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 15 мин. Затем реакционную смесь сливают, и в лунках остается только связанный с антителами меченый антиген. Далее во все лунки с пробой, стандартом и контрольным образцом добавляют раствор субстрата. Набор оптимизирован таким образом, что он позволяет визуально различить концентрации прогестерона от 2 до 10 мг/мл. Интенсивно розовая окраска указывает на то, что животное находится в состоянии овуляции. Пробы с повышенным уровнем прогестерона дают легко различимую светло-розовую окраску. Связь между визуальной оценкой результатов анализа и оптической плотностью продуктов ферментативной реакции при 540 нм представлена на рис. 2. На рис. 3 показан внешний вид набора. Этот пример показывает, как обычную методику типа ИФА можно оптимизировать, подобрав соответствующие стандарты, антитела, метку и субстрат, и таким образом создать набор, пригодный для надежного определения гормона в полевых условиях.
Существует множество наборов, представляющих собой варианты OvucheckCowside; основой большинства из них является ИФА. Соответствующие методики могут заметно различаться в деталях. Для количественного определения прогестерона в молоке предлагались, например, в качестве твердой фазы для иммобилизации антител полимерные палочки. Разрабатывается ряд методик типа ИФА для определения концентрации прогестерона в плазме, предназначенных для определения репродуктивного статуса крупного рогатого скота, лошадей и свиней.
1.2 Сульфат эстрона
Сульфат эстрона представляет собой сульфопроизводное стероида; он секретируется в относительно большом количестве фетоплацентой. Концентрация этого соединения в крови или молоке коров и свиней является надежным показателем фертильности. Определение концентрации Oe1-3-S дополняет результаты определения прогестерона у элитных животных. Разработано несколько методик ИФА для определения Oea-3-S в молоке и сыворотке коров. Так как молекулярная масса Oe1-3-S невелика, его иммунохимическое определение возможно только с помощью конкурентных методов иммуноанализа. В настоящее время наборы для определения Oe1-3-S промышленностью не производятся.
1.3 Сывороточный гонадотропин жеребых кобыл
Сывороточному гонадотропину жеребых кобыл также уделялось большое внимание как потенциальному диагностическому маркеру. Поскольку PMSG представляет собой смесь белков, то для измерения концентрации этого гормона в сыворотке лошадей можно использовать неконкурентный иммуномстрический анализ. Фирма MonoclonalAntibodiesInc. разработала набор Marecheck, позволяющий определить PMSG в течение 30 мин. В этом наборе антитела иммобилизованы на специальной палочке, которую после реакции с определяемым веществом помещают в раствор меченных ферментом антител против другого эпитопа. Палочку промывают и погружают в раствор субстрата; результаты ферментативной реакции оценивают визуально.
2. Диагностирование инфекционных заболеваний
Внедрение методик иммуноанализа способствовало дальнейшему развитии диагностической микробиологии. Иммуноанализ имеет ряд преимуществ перед традиционными методами анализа, такими, как гемагглютинация, ингибирование гемагглютинации, нейтрализация, фиксация комплемента, иммунное слипание и изучение тканевых культур. В частности, в диагностике инфекционных заболеваний в ветеринарии широкое распространение получил иммуноферментный анализ; использовались также радиоиммуноанализ и, позднее, метод латексной агглютинации. До недавнего времени эта область диагностики была менее развита; по сути дела, в ветеринарию переносили методики, разработанные для диагноза инфекций человека. Примером может служить определение ротавируса – одного из агентов, вызывающих воспаление тонкой кишки. Действительно, методики ИФА и латексной агглютинации, предназначенные для определения ротавирусной инфекции у человека, в настоящее время используются и в ветеринарной диагностике. В отличие от. наборов для оценки фертильности, с которыми работает сам фермер, диагностика инфекционных болезней будет, вероятно, выполняться в центральной лаборатории или ветеринарной лечебнице. Наиболее распространенные инфекционные заболевания, для диагностики которых выпускаются иммунодиагностические наборы, перечислены в табл. 2.