Человеческий лейкоцитарный интерферон является видоспецифическим гликопротеидом, синтезируемым донорскими лейкоцитами в ответ на воздействие интерфероногена.
Специфичность препарата определяется следующими признаками:
А) противовирусной активностью. В разведении, соответствующем титру активности, препарат должен защищать культуру человеческих клеток от цитопатического действия индикаторного вируса, взятого в дозе 100 ТЦД50
Б) устойчивостью активности к действию нуклеаз-РНК-азы и ДНК-азы;
В) чувствительностью активности к действию трипсина - при концентрации фермента 300 мкг/мл в течение Iчаса при 37°С препарат полностью инактивируется;
Г) чувствительностью активности к действию специфической антисыворотки - антиинтерфероновая сыворотка в разведении, соответствующем титру должна снижать защитное действие интерферона, взятого я количестве 10 ед, в реакции нейтрализации.
Основные требования к препарату.
Препарат должен быть вирусологически стерильным, нетоксичным и безвредным.
В разведении, соответствующем титру активности, препарат должен защищать культуру человеческих клеток от цитопатического действия индикаторного вируса.
Сухой препарат - пористый порошок серовато-коричневого цвета, легко растворимый в 2 мл дистиллированной воды. Остаточная влажность не должна превышать 2%,
Раствор препарата должен иметь различные оттенки красного цвета и желтоватый оттенок.
ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА
Кровь заготавливают на станциях переливания крови в соответствии с действующими инструкциями, в стерильные многокамерные мешки или флаконы, заполненные консервирующим раствором.
Пластикатные мешки центрифугируют 4 мин при 4°С и из них выжимают последовательно - плазму, а затем 40 мл верхнего слоя с поверхности клеточной фракции (эритромасса) или 40 мл верхнего слоя клеточной фракции (лейкомасса), которые используют в дальнейшем в качестве источника лейкоцитов для биосинтеза препарата.
Образец крови, плазмы, эритромассы или лейкомассы от каждого донора, должен контролироваться на отсутствие инфицирования сифилисом, гепатитом, СПИДом в соответствии с действующими инструкциями. При отрицательных результатах контроля эритромасса и лейкомасса могут использоваться для производства интерферона не позднее, чем спустя сутки после забора кровиот донора. Хранение их допускается при температуре не выше 4°С.
Плазма или сыворотка донорской крови входят в состав культуральной смеси на всех стациях биосинтеза интерферона.
Культивирование и контроль проиизводственных штаммов вирусов, получение культур куриных и человеческих фибробластов.
В производстве интерферона в качестве интерфероногена используется вакцинный штамм "Н" вируса болезни Ньюкасла. Это представитель группы парамиксовирусов, для которых характерна сферическая форма вирусов, и спиральная структура нуклеокапсида. Вирус легко репродуцируется в куриных эмбрионах и культуре куриных фибробластов, оказывая цитоплазтическое действие. Вирус неопасен для человека, однако может вызвать воспалительные явления при случайном попадании массивной дозы в глаз.
Индикаторным вирусом служит штамм "Индиана" вируса везикулярного стоматита.
Это представитель группы рабдовирусов, также имеющих спиральную структуру нуклеокапсул, но инфекционный вирион по форме напоминает пулю. Вирус хорошо репродуцируется в куриных эмбрионах, а также в культурах куриных и человеческих фибробластов, оказывая цитопатическое действие.
Необходимо соблюдать осторожность при работе с этим вирусом.
Методы культивирования вирусов
Вирус болезни Ньюкасла культивируют в 9-10-дневных куриных эмбрионах. Эмбрионы просматривают через овоскоп, павшие отбраковываются, а у жизнеспособных карандашом обводятся границы воздушной полости.
При исходном титре вируса 108-109 ТЦД50/мл заражающая доза составляет 0,2 мл разведения 10-4 . Эта доза вводится в эмбрион шприцем через воздушную полость с соблюдением условий стерильности. Место прокола в скорлупе заливается парафином и эмбрионы инкубируются 2-е суток при 37°С.
После инкубации эмбрионы охлаждают при 4°С в течение 3-4 часов, затем в строго стерильных условиях вскрывают со стороны воздушной полости и визуально оценивают их жизнеспособность. Павшие - отбраковывают, а из остальных пастеровской пипеткой (с помощью вакуума или груши) отсасывают алантоисную жидкость, которая и служит в дальнейшем источником вируса.
Вируссодержащую аллантоисную жидкость контролируют на бактериологическую стерильность. Определяют инфекционный титр в культуре куриных фибробластов и титр гемагглютининов.
Контроль на стерильность. осуществляют высевом I мл аллантоисной жидкости из каждого флакона на питательные cpeды - сахарный бульон и среду Сабуро. Посевы инкубируют в течение 7 суток, на сахарном бульоне при 37°С, а на среде Сабуро - при комнатной температуре.
Инфекционный титр определяют в культуре фибробластов. В 3-х суточную культуру со сформировавшимся монослоем клеток вводятся различные разведения (от 10-7 до 10-10) алантоисной жидкости. Культуры инкубируют 3-е суток при 37°С и затем просматривают под микроскопом.
Максимальные разведения, оказывающие в культуре цитопатическое действие, принимаются за ТЦД вируса (титр цитопатического действия).
_Титр гемагглютининов определяется стандартным методом постановки реакции гемагллютинации с использованием куриных эритроцитов (0,5%).
Титр гемагглютининов не является ведущей характеристикой вирусов и постановка реакции гемагглютинации не является обязательной для каждой партии вируса.
В производстве допускается использование только бактериологически стерильного вируса с инфекционным титром 10-8-10-9/1 мл ТЦЦ50и титром гемагглютининов 250 - 1000.
Вирус болезни Ньюкасла представляет большую ценность для производства, поэтому должны быть приняты меры к тому, чтобы сохранить его чистоту и интерфероногенные свойства. Категорически запрещается непрерывное использование пассирование вируса: в качестве исходного материала при заражении используют лучшую партию вируса, которую после контроля разливают по I мл в ампулы и лиофилизируют.
После лиофилизации эта партия в дальнейшем считается рабочим стандартом вируса.
Рабочий стандарт вируса контролируют описанными методами на бактериологическую стерильность, инфекционный титр и титр гемагглютининов. Затем в обязательном порядке вирус идентифицируют.
Идентификацию вируса болезни Ньюкасла проводят постановкой стандартной реакции торможения гемагглютинации с антисывороткой. Антисыворотка в разведении, соответствующем титру, но не ниже, чем 1:1000, должна полностью подавлять агглютинацию куриных эритроцитов /0,5%/ при дозе вируса, равной 4АЕ.
Получение первично-трипсинизированных, культур кожно-мншечной ткани куриных и человеческих эмбрионов.
Культуры кожно-мьшечной ткани куриных и человеческих эмбрионовшироко используют в производстве интерферона для контроля вирусов, а также для определения отсутствия токсичности и противовирусной активности препарата. Успешная работа производства в значительной степени зависит от уровня ведения культур клеток.
Для получения культур клеток применяют стандартные методы, основанные на дезинтеграции ткани эмбриона трипсином. При выращивании культур следует обратить самое серьезное внимание на качество сред, сыворотки, вспомогательных растворов и чистоту посуды.
Получение культуры куриных фибробластов
Источником ткани являются 9-10-дневные куриные эмбрионы с соблюдением условий строгой стерильности эмбрион извлекают из скорлупы на стерильную чашку Петри. Отбирается кожно-мышечная ткань, переносится в колбу Эрленмейера и промывается раствором Хенкса с антибиотиками (50 ед/мл пенициллина + 100 ед/мл стрептомицина или 20 ед/мл мономицииа). Промывные воды сливают и ткань измельчают, размеры кусочков 1-5 мм. Затем ткань заливают подогретым до 37°С раствором трипсина (0,2%), разведенным раствором Хенкса (1:1). Колбу с тканью помещают на магнитную мешалку, включают вращение. Через 5 мин. вращение прекращают и после оседания кусочков ткани надосадочную жидкость сливают с соблюдением условий строгой стерильности. В колбу вновь заливают подогретую до 37°С смесь растворов трипсина и Хенкса. Суспензию перемешивают 5-7 мин. Затем вращение останавливают и после оседания крупных кусочков ткани надосадочную жидкость переливают в стерильные центрифужные стаканы с пробкой. Суспензий центрифугируют при 1250 об/мин, в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок клеток суспендируют в культуральной жидкости следующего состава: среда №199 - 30%, гидролизат лактальбумина - 50%, нормальная бычья сыворотка - 20% и антибиотики.
Такую операцию трипсинизации повторяют 4-6 раз, но клетки собирают в один флакон с культуральной жидкостью.
После окончания сбора суспензию тщательно перемешивают и клетки подсчитывают в счетной камере Горяева. Суспензию разводят культуральной жидкостью до такой степени, чтобы в I мл содержалось 650 000 –750 000 клеток. Затем суспензию разливают в стерильные пробирки по I мл и инкубируют при 37°С в течение 2-3 суток, до образования монослоя клеток.
Технологический процесс изготовления лейкоцитарного интерферона подразделяют на 7 стадий и 12 операций,
Стадия 1- Выделение лейкоцитов.
Биосинтез интерферона проводят с использованием лейкоцитов, освобожденных от примеси эритроцитов. В тех случаях, когда примесь эритроцитов превышает 100 клеток на I лейкоцит, например, в эритромассе для их отделения необходимо применить фракционирование с последующим гемолизом лейкоцитсодержащей фракций. Если содержание эритроцитов меньше 100 клеток на I лейкоцит, ограничиваются только гемолизом.
Операция.1. Фракционирование.