Смекни!
smekni.com

Распределение антигенов системы HLA у больных туберкулезом и здоровых представителей русской этнической группы Челябинской области (стр. 8 из 11)

У больных туберкулезом и у больных лепрой установлена положительная ассоциация с HLA-DRB1-16-специфичностью. В то же, время повышение частоты встречаемости DRB1-17, DQB1-0201 и - 0303 характерно для больных туберкулезом, а DRB1-15, DQA1-0102 - для больных лепрой. У больных туберкулезом установлена отрицательная ассоциация с аллелем DQB1-0301 (таблица 3).

При анализе распределения частот гаплотипов обнаружено достоверное увеличение частоты встречаемости гаплотипа DRBl-16-DQA1-0102-DQB1-0502/04 (р < 0,05) в обеих группах больных.

Кроме того, у больных туберкулезом достоверней чаще по сравнению как с контролем, так и с больными лепрой встречался гаплотип DRB1-17-DQA1-0501-DQB1-0201 (р < 0,01); RR = 3,5. У больных лепрой и туберкулезом с низкой частотой определялся гаплотип DRB1-11-DQA1-0501-DQB1-0301 (таблица 4), однако статистически значимыми различия были только у больных лепрой (р < 0,05).

Таким образом, полученные результаты подтверждают вовлеченность в процессы возникновения и развития лепры и туберкулеза генетических факторов, ассоциированных с аллелями DRB1, DQA1 и DQB1 комплекса HLA. В последние годы стало известно, что полиморфизм системы HLA характерен для каждой конкретной группы населения, что оказывает определяющее влияние на биологическую стабильность данной группы.

Молекула МНС приобретает стабильную форму и соответствующую трехмерную конфигурацию только после того, как в связывающий сайт ее складки встраивается пептид. Пептидное связывание и последующий запуск иммунных реакции решающим образом зависят от аллельных вариантов молекулы HLA. Анализ последовательностей показал, что по одному аминокислотному варианту можно различать продукты DRB1-1501 от DRB1-1502 и DRB1-1601 от DRB1-1602. Можно полагать, что специфичность DRB1-16 или ее аллельные варианты избирательно нацелены на презентацию общих патогенных пептидов Mycobacterium leprae и Mycobacterium tuberculosis Т-клеткам. В то же время выявление DRB1-17-специфичности у больных туберкулезом, вероятно, свидетельствует о наличии патогенных мотивов у HLA-аллеля, стимулирующего Т-клеточные клоны, которые приводят к формированию ответной иммунной реакции, обусловливающей патогенез данного заболевания. Гаплотип DRB1-16-DQA1-0102-DQB1-0502/04 имеет низкую частоту встречаемости во многих популяциях. Так, у здоровых индусов он находится в пределах 4-5% с повышением, хотя и недостоверным (возможно, из-за малого числа наблюдений), у больных лепрой и туберкулезом. В русской популяции эти различия оказались статистически значимыми. Весьма вероятно, что пептиды, принадлежащие Mycobacterium leprae и Mycobacterium tuberculosis, связываются с конкретными эпитопами аллельных вариантов HLA-DRB1-генов и стимулируют Т-клеточные клоны, которые приводят к запуску иммунных ответных реакций, лежащих в основе патогенеза указанных микобактериозов. Возможно, ассоциации с DRB1-16-специфичностью или с ее аллельными вариантами свидетельствуют о предрасположенности к микобактериозам, наличие же в генотипе человека DRB1-17-специфичности (особенно гаплотипа DRB1-17-DQA1-0501-DQB1-0201) увеличивает риск развития туберкулезной инфекции в русской популяции.

Установление молекулярных механизмов распознавания антигенов является необходимой базой для дальнейшей коррекции силы иммунного ответа индивидуума в отношении любого антигенного воздействия. Прогресс на этом пути очевиден, так как уже сейчас показано, что замена всего лишь единственной аминокислоты в последовательности антигенсвязывающего участка молекулы гистосовместимости может приводить к развитию толерантности. Такого рода подходы открывают новые перспективы в борьбе с различными заболеваниями, в том числе с туберкулезом и лепрой.

II. Собственные исследования

2.1 Материалы и методы исследования

2.1.1 Контингент обследуемых лиц

Иммуногенетическое типирование проводилось среди русской этнической группы, постоянно проживающей в Челябинской области. Исследование включает 51 больного туберкулезом, находящегося на стационарном лечении в ГУЗ "Противотуберкулезный диспансер № 3", представителей социально благополучных слоев населения, имеющих родственников русской национальности в трех поколениях. Группу сравнения составили 202 случайно выбранных донора Областной станции переливания крови (г. Челябинск) русской национальности.

2.1.2 Иммуногенетическое типирование

Работа выполнена на базе зональной лаборатории иммуногенетического типирования тканей ОГУП "Челябинской областной станции переливания крови" г. Челябинск.

Генотипирование проводилось методом полимеразной цепной реакции с аллель специфическими праймерами (PCR-SSP) с помощью наборов реагентов, предложенных "НФП ДНК-Технология" (Москва). Идентификацию аллелей HLA II класса проводили методом амплификации с использованием 19 смесей праймеров для DRB1 локуса, 26 для DQB1 локуса и 12 смесей праймеров для DQA1 локуса. Для ПЦР использовался термоциклер МС-2 ("ДНК-технология", Москва, Россия).

Постановка реакции:

Для постановки используется ДНК, выделенная из венозной крови по стандартной методике (разрушение клеток и экстракция ДНК) путем последовательной обработки клеток лизирующим буфером.

В каждую пробирку, содержащую ДНК-pol, дезоксинуклеозид-трифосфаты, хлорид магния, оптимизированную буферную систему для ПЦР вносится по 10 мкл ПЦР растворителя.

Растворенная смесь с помощью автоматического дозатора раскапывается в пробирки по 5 мкл.

В каждую пробирку под масло добавляется по 2,5 мкл определенного праймера и 2,5 мкл раствора выделенной ДНК.

Для проведения амплификации используются последовательно связанные программы, приведенные для амплификатора типа МС-2, запрограммированного на объем 10 мкл. Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурации, отжига и элонгации.

Детекция результатов проводится с помощью гельэлектрофореза в 3% агарозном геле. Для этого в готовые пластины геля в лунки вносится по 5 мкл пробы. Затем пластинка помещается в ванночку и проводится электрофорез в течение 10 мин.

Учет результатов проводится визуально с помощью трансиллюминатора. При этом агарозный гель достается из кюветы и помещается на стекло трансиллюминатора. Продукты реакции амплификации выглядят в виде светящихся полос, наблюдаемых визуально в УФ-свете трансиллюминатора. Результаты фиксируются посредством фотографирования или видеосъемки геля при использовании УФ-фильтров и заносятся в протокол [28].

2.1.3 Методы статистической обработки

В плане наследования антигенов гистосовместимости человеческая популяция является панмиктической и подчиняется закону Харди - Вайнберга, выражающейся формулой наследования для системы с двумя признаками:

p2 + 2рq + q2 = 1,которая отражает количество гомо - и гетерозиготных по соответствующему гену индивидов в выборке.

Часть антигенов рассчитывается как процентное (долевое) соотношение индивидуумов, несущих антигены к общему числу обследованных, а частота гена по указанной выше формуле после ее преобразования:

p2x + 2px (1 - px) + (1 - px) 2 = 1; но так как,

p2x + 2px (1 - px) = Ax,

1 - px =

и

px = 1 -

,

где Px - частота гена;

Аx - частота антигена.

Определенная по формуле частота гена должна быть проверена путем сравнения наблюдаемого в выборке распределения гомо - и гетерозиготных индивидуумов с теоретически рассчитанной в соответствии с законом Харди-Вайнберга.

Достоверность различий в частоте встречаемости антигенов у больных туберкулезом и здоровых людей русской национальности, проживающих в Челябинской области, рассчитывается согласно критерию Пирсона:

,

где N - это число обследованных в двух сравниваемых группах;

а - число индивидуумов несущих исследуемый антиген среди больных туберкулезом;

в - число индивидуумов не несущих исследуемый антиген среди больных туберкулезом;

с - число индивидуумов несущих исследуемый антиген среди здоровых русских;

d - число индивидуумов, не несущих исследуемый антиген среди здоровых русских.

Важным элементом популяционного анализа являются гаметные ассоциации, которые учитывают разницу в теоретически определенной ассоциации между 2-я антигенами разных локусов и истинной ассоциацией, встречающейся в популяции. К необходимости введения данного показателя приводит рассуждение: если бы аллели исследуемых локусов встречались независимо друг от друга, часть их ассоциаций на хромосоме (гаплотип) определялась бы произведением Р1×Р2, где Р1 и Р2 - частота соответствующих генов. Однако в популяции частота отдельных аллелей встречаются более часто или наоборот, более редко, чем это следует из теоретического расчета, то есть данные гены находятся в состоянии неравновесного сцепления (linkage disequilibrium), которое измеряется величиной Δ, отражающее превышение или дефицит гаплотипа в популяции по сравнению с произведением частот двух генов.

Величина Δ подсчитывается из ''сетки'' 2×2 по формуле (P. Mattiusi 1970г)

n - число обследованных в выборке

b - число индивидуумов несущих X и не несущих Y

с - число индивидуумов несущих Y, но не несущих X

d - число индивидуумов не несущих ни X ни Y.

Приведенная формула входит составной частью в формулу, используемую для определения частоты гаплотипа в панмиктической популяции