Роль опіоїдів у регуляції механізмів апоптозу при гострій серцевій недостатності в експеріменті (стр. 2 из 5)
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були повідомлені й апробовані на I-й регіональній науково-практичній конференції молодих вчених і студентів “Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні” (м. Луганськ, 2005 р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, інтернів і молодих вчених “Проблеми захисту інтелектуальної власності в медицині та біології” (м. Луганськ, 2005 р.); II-й регіональній науково-практичній конференції молодих учених і студентів “Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні” (м. Луганськ, 2006 р.); 60-й ювілейній науково-практичній конференції студентів і молодих вчених “Актуальні проблеми сучасної медицини”, (м. Київ, 2006 р.); IX-му Українському біохімічному з’їзді (м. Харків, 2006 р.); міжкафедральних засіданнях працівників кафедри медичної хімії й науково-дослідницького центру Луганського державного медичного університету.
Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 14 наукових праць. Серед них: 6 статей у фахових виданнях (2 – без співавторів), 3 патенти на корисну модель, 5 тез доповідей у матеріалах п’ятьох наукових конференцій.
Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 4 розділів основної частини (огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, розділу результатів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень), висновків і списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 7 таблицями й 34 рисунками. Повний обсяг дисертації – 110 сторінок. Список літератури 250 джерел (87 кирилицею, 163 латиницею).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали й методи дослідження. Експеримент було проведено на 492 білих щурах-самцях 16–18-тижневого віку, маса яких становила 250–300 грам. При постановці експерименту ми керувалися “Загальними етичними правилами експериментів на тваринах”, ухваленими I Національним конгресом з біоетики від 20 вересня 2001 року, Київ, Україна. Протокол експерименту узгоджений з комісією з біоетики Луганського державного медичного університету.
У тварин формували ГСН шляхом введення доксорубіцину гідрохлориду (ВАТ “Київмедпрепарат”, м. Київ) у дозі 20 мг/кг у вигляді 2 % водного розчину одноразово інтраперітонеально. Контрольним щурам вводили відповідний об’єм 0,9 % ізотонічного розчину натрію хлориду. Тварин спостерігали до сьомої доби експерименту включно.
Даларгін (синтетичний лей-енкефалін, D-Ala2-Leu5-Arg6-енкефалін) (ЗАТ “БИОЛИК”, м. Харків) вводили інтраперітонеально в дозі 100 мкг/кг маси щурів у вигляді 0,1 % водного розчину за 20 хвилин до формування ГСН протягом усіх діб її розвитку. Ін'єкцію налоксону (антагоніст ОР) (ЗАТ “БИОЛИК”, м. Харків) у дозі 0,5 мг/кг у вигляді 0,04 % водного розчину вводили інтраперітонеально за 20 хвилин до введення даларгіну й протягом періоду спостереження, одноразово.
Неселективне інгібування АТФ-чутливих К+АТФ-каналів викликали ін'єкцією глібенкламіду (ТОВ “Фармацевтична компанія “ЗДОРОВ’Я”, м. Харків) у дозі 0,3 мг/кг у вигляді 0,05 % водного розчину за 20 хвилин до введення даларгіну протягом усього періоду спостереження.
У кожній експериментальній групі тварин проводили морфологічну детекцію апоптозу кардіоміоцитів за допомогою флуоресцентної мікроскопії з використанням барвника Хехст 33342, який зв’язується з ДНК; імунофлуоресцентний аналіз (МТТ-аналіз) і кількісне визначення генетичних маркерів апоптозу р53, Bcl-2 в тканині міокарда; у тій же тканині методом фотометрії визначали відсоток ф-ДНК (Messmer U.K., 1996), активність супероксиддисмутази (СОД) і вміст вільного СФЗ (модифікований метод Прохорової М.І., 1982); рівень NO в тканині міокарда й сироватці крові за концентрацією NO2- й NO3- (Орлова Е.А., 2001); час релаксації протонів води тих же тканин за даними ЯМР-релаксометра "Mіnіspec pc 100" фірми "Bruker" (Німеччина), укомплектованого модульними програмами: EDM 110A; EDM 510A; 511A; 610A; 612A; 613A, що дозволяють змінювати послідовність імпульсів; загальну оксидантну активність (ЗОА) і загальну антиоксидантну активність (ЗАА) сироватки.
Первинний цифровий матеріал експериментальних досліджень був оброблений традиційними методами варіаційної статистики (Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н., 2000). Для оцінки достовірності отриманих результатів був використаний критерій Стьюдента. Результати розцінювались як достовірні при р<0,05.
Результати дослідження та їх обговорення. Одним з найбільш характерних біохімічних критеріїв оцінки активності процесів апоптозу в тканині є показник фрагментації виділеної ДНК (Walker P.R., 1994). Проведені нами дослідження показали (Рис. 1), що найбільший рівень ф-ДНК при моделюванні ГСН (Шляхто Е.В. та ін., 2006; Giordano F.J., 2005) був на третю добу експерименту – 96,28 % (р<0,01) з подальшим зниженням значень до сьомої доби – 14,17 % (р<0,01). Попередня активація периферичних м- й д-ОР (Fryer R.M., et al, 2000; Лишманов Ю.Б. и др., 2000) призвела до достовірного зниження рівня ф-ДНК по відношенню до групи ГСН на третю, п’яту й сьому добу – падіння відсотка фрагментації склало 20,17 % (р<0,05), 19,56 % (р<0,001) і 6,97 % (р<0,05) відповідно.
Ці дані мали своє підтвердження при морфологічній оцінці зрізів сердець відповідних експериментальних груп із застосуванням гематоксилін-еозину й імунофлуоресцентного забарвлення за Хехстом.
При паралельному введенні глібенкламіду (неселективного блокатора К+АТФ-каналів) і даларгіну спостерігалося повне усування цитопротекторного ефекту останнього. Механізм цитопротекторної дії активаторів мітохондріальних каналів повністю не вивчено, однак встановлено, що вони поперед-жають розпад АТФ. Наші дані дозволяють припустити, що активація м- й д-ОР призводить до відкриття К+АТФ–каналів внутрішніх мембран мітохондрій, що може сприяти енергетиці клітини.
Рис. 1. Рівень фрагментації ДНК на тлі формування ГСН й при попередній активації периферичних ОР (%).
Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01);
** - показники достовірні по відношенню до групи ГСН+Дал (р<0,05);
# - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
Завдяки механізмам своєї дії білок р53 розглядається як проапоптотичний маркер (Das D. K., et al, 2004). Вивчення експресії р53 (Рис. 2) показало її значне підсилення, починаючи з першої доби: на 5,3 %, 44,6 % (р<0,01), 57,2 % (р<0,01) і 69,3 % (р<0,01) щодо групи контролю відповідно діб спостереження. Застосування даларгіну призвело до зниження експресії на третю добу на 3,2 %, на п’яту – на 21,9 % й на сьому – на 38,7 % відносно групи ГСН.
Рис. 2. Експресія р53 при активації периферичних ОР на тлі формування ГСН (%).
Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
** - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01);
# - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
Відомо, що кардіоміоцити експресують білки Bcl-2 родини (Berry С., et al., 2000). Щодо формування окисного стресу в міокарді експресія внутрішньоклітинного антиапоптотичного маркера Всl-2 (Рис. 3) супроводжувалась її зниженням на третю добу на 13,6 % (р<0,01), на п’яту – на 29,7 % (р<0,01) і на сьому – на 18,9 % (р<0,01).
Попередня активація периферичних м- й д-ОР призвела до зниження експресія на третю добу лише на 7,5 %, на п’яту – на 11,4 % (р<0,05) і на сьому – на 12,3 % щодо групи контролю (Рис. 3).
Рис. 3. Експресія Всl-2 при активації периферичних ОР на тлі формування ГСН (%).
Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
** - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01);
# - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
Трансмембранні оксидоредуктази широко включені до контролю внутрішньоклітинного окисно-відновного стану (Berridge M.V. et al., 2000). Вивчення метаболічної активності клітин міокарда за здатністю мітохондріальних НАДН-дегідрогеназ перетворювати водорозчинний МТТ у забарвлений нерозчинний у воді формазан показало (Рис. 4), що при окисному стресі зниження їх активності склало на першу добу 20,6 % (р<0,01), на третю – 21,5 % (р<0,01), на п’яту – 17,2 % й на сьому – 8,3 % (р<0,01) відносно контрольних значень.
За умов попередньої активації периферичних ОР активність мітохондріальних дегідрогеназ була нижча за контрольні значення на першу добу на 14,6 %, на третю – на 16,4 %, на п’яту – на 10,3 % (р<0,05) і на сьому – на 4,9 % (р<0,05).
Рис. 4. Активність мітохондріальних дегідрогеназ на тлі формування ГСН й при попередній активації периферичних ОР (%).
Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
** - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01);
# - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
У зв’язку з тим, що NO розглядається як біфункціональна молекула, механізм дії якої залежить від умов, за яких вона синтезується (Манухина Е.Б. и др., 2002), нами було вивчено концентрацію його стабільних метаболітів. Формування ГСН в міокарді супроводжувалося підвищенням загального рівня NOх уже з першої доби: на 30,81 % (р<0,05), 49,04 % (р<0,001), 32,17 % (р<0,01) і 14,26 % відповідно діб спостереження.
Попереднє застосування даларгіну, як активатора периферичних м- й д-ОР, призвело до зниження загального вмісту NOх. Показник був підвищеним лише на 23,04 % (р<0,01), на 30,83 % (р<0,01) (зниження на 12,22 % (р<0,05) відносно групи ГСН), на 14,59 % (р<0,05) (нижче на 13,31 % (р<0,05) щодо групи ГСН) і на 2,34 % (зниження на 10,47 % (р<0,05) відносно групи ГСН) відповідно діб спостереження.