Принцип метода: количественное установление содержания специфически окрашенных в фиолетовый цвет экстрагированных хромогенов, образующихся в результате реакции17 – КС с метадинитробензолом в щелочной среде.
Реактивы:
1.диэтиловый (медицинский) эфир, свободный от перекисей
2.абсолютный этанол, очищенный от альдегидов и кетонов - см выше
3.концентрированная соляная кислота, 1,19 кг/л
4.ледяная уксусная кислота
5.раствор едкого натра, 100 г/л
6.5 н. раствор едкого калия в метаноле (применяемый в качестве растворителя метанол делает реактив более устойчивым, увеличивая срок его хранения). 28 г едкого калия доводят до 100 мл метанолом, после чего раствор немедленно фильтруют (в спиртовом растворе щелочи образуются желто-окрашенные продукты, которые обусловливают высокие значения абсорбции контрольной пробы). После фильтрования раствор щелочи титруют 0,1 н. соляной кислотой с индикатором метилоранжем. Реактив хранят в темной запарафинированной склянке в холодильнике. Он годен до 1,5 мес.
7.спиртовой раствор метадинитробензола, 20 г/л.
Перед использованием проверить чистоту метадинитробензола: 400 мг реагента растворяют в 20 мл абсолютного этанола, он не должен давать окраски в течение 1 часа после прибавления к нему равного объема 3 н. раствора едкого калия. В противном случае реактив перекристаллизовывают.
Перекристаллизация метадинитробензола: 10 г его препарата растворяют в 375 мл 96 % этанола и нагревают до 40 С. К раствору доливают 50 мл 2 н. едкого натра и смесь оставляют на 5 минут. Затем ее охлаждают и прибавляют к ней при помешивании 1,25 л дистиллированной воды. Раствор фильтруют через воронку Бюхнера и промывают метадинитробензол на фильтре абсолютным этанолом (1 раз – 60 мл и 2 раза – по 40 мл). Кристаллизацию следует осуществлять очень быстро, чтобы образовывались мелкие кристаллы, т. к. большие плохо растворяются в спирте. Полученные мелкие игловидные кристаллы должны иметь указанную температуру плавления. Спиртовой раствор метадинитробензола держат в темной склянке с притертой пробкой 8.метанол 9.хлороформ («для наркоза») 10.раствор формальдегида, 400 г/л (формалин). Раствор разводят в соотношении 1 : 5 дистиллированной водой. 11.стандартныерастворы кетостероидов, получаемые из кристаллических дегидроэпи андростерона и андростерона. Стандартные растворы готовят в концентрации 100 мкг/мл , для чего 5 мг дигидроэпиандростерона или андростерона растворяют в 50 мл абсолютного этанола. Хранят в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой, эталон устойчив в течение нескольких месяцев. Ход определения: включает в себя несколько этапов.
1 этап. Гидролиз мочи. К помещенным в коническую (на 100 мл) колбу 20 мл мочи, взятой из ее суточного количества, прибавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 0,2 мл раствора формальдегида. Содержимое колбы перемешивают, накрывают ее воронкой и ставят в кипящую водяную баню на 15 минут. После этого колбу охлаждают под струей холодной водопроводной воды и содержимое ее переносят в делительную воронку.
2 этап. Экстракция и очистка экстракта (осуществляется в делительной воронке). Экстракцию производят диэтиловым эфиром (2 раза по 10 мл) в течение 1 – 1,5 минут. Нижний слой мочи удаляют. Эфирные экстракты объединяют, промывают тремя порциями по 10 мл раствора едкого натра (по 3 минуты). Водную, содержащую эстрогены и другие вещества кислого характера, щелочную фазу убирают и экстракт промывают 1 раз 10 мл дистиллированной воды. Воду тщательно отделяют, эфирный экстракт порциями переносят в центрифужную пробирку и выпаривают на теплой (с температурой не выше 50 С) водяной бане. Сухие экстракты (при формальдегидном способе они должны быть бесцветны) на этом этапе можно оставить до следующего дня в холодильнике.
3 этап. Количественное определение по Циммерману в модификации Креховой.
К сухому остатку приливают 0,2 мл абсолютного этанола, 0,2 мл метанольного раствора едкого калия и 0,2 мл спиртового раствора метадинитробензола. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют для развития окраски на 1 ч (в темноте!!!) при комнатной температуре. По окончании инкубации добавляют 3 мл водного раствора этанола (500 г/л) и 2 мл хлороформа, смесь энергично встряхивают. Окрашенные в фиолетовый (лиловый) цвет продукты переходят в нижний, хлороформенный слой, а продукты с неспецифической окраской – желто – коричневой или коричневой – остаются в верхнем спиртоводном слое. Через пару минут верхний слой удаляют отсасыванием (пастеровской пипеткой). Делать это нужно аккуратно, тщательно собирая капли водного слоя со стенок пробирки, не засасывать хлороформенный слой.
В хлороформенный слой добавляют 1 мл абсолютного этанола. После перемешивания интенсивность окраски раствора измеряют на фотометре с зеленым (500 – 560нм) светофильтром в кювете на на 5 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольной пробы. Окраска стабильна в течение часа, а затем интенсивность ее снижается: через 1 ч она оказывается слабее уже на 10 – 15%. В связи с этим на одно определение допустимо брать не более 10 – 15 проб.
Приготовление контрольной пробы: в две пробирки прилить по 0,2 мл абсолютного этанола, по 0,2 мл метанольного раствора едкого калия и по 0,2 мл спиртового раствора метадинитробензола. Содержимое пробирки перемешивают и деле обрабатывают как опытную пробу.
Расчет ведут по формуле или калибровочному графику. Для получения данных к расчету по формуле параллельно опытным пробам через процедуру анализа пропускают 0,5 мл основного стандартного раствора, содержащего 50 мкг андростерона или дигидроэпиандростерона.
Для получения данных к построению калибровочного графика через все этапы анализа проводят стандартный раствор андростерона (дигдроэпиандростерона) в количестве от 0,1 до 1,0 мл основного раствора. Линейная зависимость сохраняется до концентрации стандартного раствора 100 мкг/мл (100 мг/л). Экскрецию 17 – КС с мочой рассчитывают по формуле:
Х (мг/сут) = А оп * d * 50 /А ст * 20 * 1000 = А оп * d /А ст * 400
50 – содержание (мкг) андростерона или дигидроэпиандростерона в стандартной пробе
d – диурез (мл/сут)
20 – количество взятой в опыт мочи (мл)
1000 – коэффициент перерасчета, используемый для перевода мкг в мг.
Расчет по калибровочному графику проводится с использованием формулы:
Х = С * d/ 20 * 1000
С – найденное по калибровочному графику содержание 17 – КС в пробе (мкг стандартного вещества андростерона или дегидроэпиандростерона). Для перевода полученного по формуле значения из мг в мкмоль его умножают на коэффициент 3,467.
При больших концентрациях 17 – КС в моче (свыше 100 мкг в пробе) дальнейшее исследование сводится к:
1.использование кюветы на 10 – достигается разведение мочи в 5раз
2.развести мочу физиологическим раствором
В формулу ввести поправку на разведение.
Референтные значения:
| возраст | Содержание17 – КС в моче мг/сут | Содержание 17 – КС в моче мкмоль/сут |
| Грудные дети 0 – 1 год | Менее 1,0 | Менее 3 |
| Дети 1- 10 лет | Менее 5,0 | Менее 17 |
| Подростки 11 – 14 лет | Менее 12 | Менее 42 |
| Взрослые мужчины | 5 – 23 | 17 – 80 |
| Взрослые женщины | 3 – 15 | 10 – 52 |
| Мужчины старше70 лет | 3 – 12 | 10 – 42 |
| Женщины старше 70 лет | 3 - 13 | 10 – 45 |
Максимальная величина экскреции у мужчин и женщин наблюдается в возрасте25 лет, после чего начинается ее медленное снижение. Выделение 17 – КС выше в часы бодрствования, чем в часы сна. При любых состояниях напряжения экскреция 17 – КС возрастает.
4. Клинико–диагностическое значение определения 17 – КС в моче
1.Выделение 17 – КС с мочой значительно увеличивается при:
1.интерстициально – клеточной опухоли яичка
2.арренобластоме
3.лютеоцитароной опухоли яичника
2. Выделение 17 – КС умеренно увеличивается при:
1.опухоли надпочечников
2.врожденной и приобретенной гиперплазии надпочечников
При раке коры надпочечников уровень 17 – КС в моче возрастает в 2 – 10 раз, достигая иногда 300 мг/сут. Метастазирующая раковая опухоль надпочечников – до 1000 мг /сут.
3.Выделение 17 – КС с мочой снижается при:
1.аддисоновой болезни (составляет не более 1/5 – 1/3 от нормальной величины)
2.диэнцефально – гипофизарной кахексии
3.гипофизарном карликовом росте
4.гипотериозе
5.синдроме остаточных гонад
6.анорхии
7.циррозе печени
8.нефротическом синдроме
9.истощении
Факторы, влияющие на результат исследования:
1.Искажающие результат:
1.несоблюдение требований, предъявляемых к исследованию
2.неправильное хранение контейнера
3.невозможность собрать всю мочу за время исследования
4.несвоевременная отправка мочи в лабораторию
2.Повышающие результат:
1.цефалотин
2.дигитоксин
3.мепробамат
4.напроксен
5.пенециллин
6.фенотиазин
7.АКТГ
8.кортизон ацетат
9.гидрокортизон
3.Понижающие результат:
1.хлордиазепоксид
2.глюкоза
3.меглумин
4.ампициллин
5.дексаметазон
6.эстрогены
7.пероральные контрацептивы
8.преднизолон
Библиография
1.Камышников В.С. «Клинико – биохимическая лабораторная диагностика», том 2, Минск «Интерпрессервис», 2003 г , стр 350 – 366
2.Меньшиков В.В. «Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике», Москва «Медицина», 1987 г , стр 250 – 253
3.Елесеев Ю.Ю. «Анализы. Полный справочник», Москва «Эксмо», 2006 г стр 187 – 190.
4.Земцов В.К. «Диагностика по основным показателям лабораторных исследований», Ростов – на - Дону, «Феникс», 2008 г, стр 15 – 16
5.Баулин С.И. «Справочник медсестры – лаборантки», Ростов – на - Дону, «Феникс», 2008 г, стр 175 – 177
6.Покровский В.М. «Физиология», Москва, «Медицина», 2006г, том 3, стр 234 – 256.