Стандартные препараты и эффекты матрикса (стр. 2 из 3)

Однако реализация такой программы предполагает выполнение громадного объема научной, организационной и практической работы и соответствующие расходы. Фактически затраты на введение международного стандарта при этом должны были бы удвоиться. Соответствующие предложения были распространены ВОЗ в 1985 г. для выяснения мнения ученых, фирм - производителей наборов и национальных органов контроля [2]. Спектр поступивших откликов был очень широк, начиная от полной поддержки идеи введения контрольного матрикса фирмами, выпускающими наборы, до прямо противоположной точки зрения, согласно которой все проблемы эффекта матрикса могут быть решены с помощью соответствующей оптимизации метода анализа.

Совместные исследования. В конце концов было решено поддержать идею проверки и получения экспериментальных доказательств того, насколько введение общего матрикса улучшило бы соответствие результатов анализов. Для этой цели была создана совместная рабочая группа ВОЗ и IFCC, в задачи которой входило выяснение влияния двух различных материалов, используемых в качестве матрикса при анализе TSH. Выбор этого гормона был обусловлен тем, что его определение должно быть как можно более точным и чувствительным для получения необходимой в клинической практике информации. Кроме того, препараты TSH гетерогенны, нестабильны и трудно поддаются стандартизации.

Получение сыворотки с низкими концентрациями TSH представляет собой сложную проблему, поскольку ее получают только от больных, страдающих определенными видами тиреоидной аденомы. В гораздо больших количествах такую сыворотку можно получить от здоровых людей, у которых их собственная тиреоидная функция была подавлена введением Тз в течение нескольких дней. Последние разработки предлагают еще более простой способ получения матрикса путем обработки уже непригодной для клинического применения плазмы из банка крови с помощью лектинов, которые адсорбируют эндогенный TSH. В настоящее время проводятся совместные эксперименты с первыми двумя типами сывороток. Полученные результаты и выводы будут представлены в Экспертный комитет ВОЗ по биологической стандартизации.

ВЛИЯНИЕ ОБНОВЛЕНИЯ МЕЖДУНАРОДНЫХ СТАНДАРТОВ

Первые стандарты для научно-исследовательских работ. Сейчас ясно, что научно-исследовательские работы в области иммуноанализа развивались столь быстрыми темпами за счет введения общего стандартного материала на самых ранних этапах исследований. Благодаря этому лаборатории обеспечивались достаточно хорошими стандартными препаратами при разработке методов очистки и количественного определения. В 60-х гг. Отдел биологических стандартов Национального института медицинских исследований (NIMR) ввел научно-исследовательские стандарты для ряда веществ (кальцитонин свиньи, эритропоэтин, гипофизарные гормоны человека FSH, LH, TSH, GH, пролактин). Скоро стало очевидным, что сопоставление качественных и количественных данных сильно облегчается, если для сравнения использован один и тот же стандартный препарат. Впоследствии некоторые из научно-исследовательских стандартов NIMR были приняты Экспертным комитетом ВОЗ по биологическим стандартам в качестве международных. Кроме того, система единиц, используемая в научно-исследовательских стандартах, была принята за основу при разработке применяемых сейчас международных единиц.

Выбор подходящего материала. Одной из первых проблем при введении научно-исследовательских стандартов стал выбор соответствующего материала. На ранних этапах исследования молекулярная структура вещества часто вообще или почти неизвестна. В этом случае обычно используют тот доступный материал, который в рамках имеющейся о нем информации считается наиболее подходящим. Очень часто приходится использовать грубый неочищенный экстракт или даже необработанные и нефракци-онированные физиологические жидкости, например сыворотки. В случае ряда веществ, например гормонов, которые идентифицируют на первых стадиях исследования по их биологической активности, исходный материал, используемый для приготовления стандарта, обычно представляет собой концентрированный экстракт, пригодный для характеристики гормона и применения в биоанализах invivo. Если же неизвестна подходящая биологическая функция, пригодная для контроля определяемых веществ (таковы, например, неактивные предшественники или метаболиты), то наиболее разумным будет использование индивидуальной или смешанной сыворотки.

Замена некорректных стандартов. Внедрение научно-исследовательских стандартов может сопровождаться рядом затруднений. Данный материал может оказаться непригодным для стандарта чаще всего в силу того, что он содержит или определяемое вещество в денатурированном виде, или его предшественники и метаболиты, или другие вещества, достаточно близкие по молекулярной структуре, в таких количествах, которые могут помешать протеканию иммунологической реакции. Если такие факты точно установлены, необходимо заменить "неподходящий" стандарт на другой, состоящий по возможности из наиболее чистого препарата, имеющегося в распоряжении. Следует подчеркнуть, что стандарт является только "рабочей гипотезой материала". Это всего лишь препарат, который, по имеющимся в настоящее время сведениям, можно использовать для корректного количественного определения данного вещества. В любой момент в свете новых научных данных этот стандарт может оказаться неподходящим

Замена "грязных" стандартов. Очень часто не понимают значения и причин замены одного стандарта на другой, более высокой степени чистоты. Если меняется международный стандарт, то последствия непонимания причин такой замены могут проникнуть в национальное законодательство, промышленность и клиническую практику. Поэтому очень важно ясно представлять себе, почему заменен данный стандарт и что в этом случае следует делать.

~ Рассмотрим первый стандарт, в данном количестве которого (массе, содержимом ампулы) содержится х молекул вещества А и некоторое количество молекул, сходных по ряду свойств (например, иммунореактивности) с веществом А. Этот стандарт заменяют на другой, содержащий удвоенное количество 2х (на мг или на ампулу) чистого вещества А. Когда второй стандарт анализируют с помощью метода, специфичного к А (т.е. когда определяется только А), то результаты анализа должны Показать удвоенное содержание А во втором стандарте по отношению к первому стандарту. Если же второй стандарт анализируют с помощью метода, в котором взаимодействуют и примеси, подобные А, и находящиеся в первом стандарте, то количество вещества А во втором стандарте по данным этого анализа будет меньше Ъс. Степень занижения результатов зависит от специфичности данного анализа. Эта проблема описана в работе [3] и проиллюстрирована на рис. 2.1. Как отмечал профессор Финяи, важна не столько математика биологической стандартизации, сколько понимание лежащих в ее основе принципов.

Последствия внедрения международного стандартного препарата (МСП) для определения хорионического гона-дотропина человека. Ярким примером того, какие недоразумения могут возникнуть при замене "грязного" международного стандарта на другой, содержащий более чистый материал, является ситуация, возникшая в ходе внедрения второго международного стандарта (МО хорионического гонадотропина человека (hCG) для калибровки международного стандартного препарата (МСП), предназначенного для иммуноанализа hCG. Определение hCG в сыворотке крови или в моче используют для диагностики ранних стадий беременности. Естественно, чем более чувствителен тест, тем ранее он даст положительный сигнал. При перекалибровке различных продажных наборов по новому МСП в тех наборах, в которых происходило неспецифическое взаимодействие с многочисленными примесями, содержащимися во 2-м МС (а- и /5- субъединицы, денатурированные формы hCG), пришлось менять градуировку стандартов, входящих в-наборы. В результате такой замены ухудшилась истинная чувствительность определения почти всех наборов. Последствия оказались весьма неприятными, поскольку пришлось давать объяснения медикам и потребителям наборов. Такие объяснения были опубликованы [4, 5]. Корректность нового МСП была подтверждена с помощью специфических моноклональных антител [6]. Этот пример не является единственным. Подобная ситуация может возникнуть сейчас после введения в 1986 г. нового международного стандарта для FSH; перекалибровка соответствующих иммуноаналитических наборов (в некоторых случаях в 5 раз), по-видимому, встретится с теми же трудностями, что и в случае hCG.

Первый международный стандарт для гипофизар-ного FSH. Ввиду важности определения гипофизарного и сывороточного FSH первый международный стандарт и второй МСП были введены именно для этих гормонов (МСП также для LH). Эти МСП были приготовлены профессором Рейчертом в лаборатории профессора Вильгельми путем экстракции гипофизов, хранившихся в ацетоне. Оригинальный исходный материал известен в Америке под шифром LER 907. Часть этого материала была лиофилизо-вана в ампулах (код 69/104) в Отделе биологических стандартов NIMR и в дальнейшем была использована в качестве научно-исследовательского стандарта. Полученный препарат был принят ВОЗ в 1.973 г. в качестве МСП для биоанализа гипофизарных FSH и LH [7 ]. Когда первая серия ампул (около 3500 штук) была израсходована, в качестве второго МСП для биоанализа FSH и LH стали использовать новую серию (код 78/549), также полученную из LER 907. Хотя различные аликвоты одного и того же материала были обработаны аналогичным образом [8], нельзя утверждать, что по составу LER 907, 69/104 и 78/549 идентичны, поскольку неизвестно, какие молекулярные изменения произошли в образцах в процессе хранения и лиофилизации.