Особистий внесок здобувача. У наукових працях, опублікованих самостійно та зі співавторами особисто автором:
- проведений аналіз літературних даних щодо ботанічної характеристики, розповсюдження кульбаби лікарської, хімічного складу і використання кульбаби лікарської в медицині;
- встановлено основні групи БАР в листі та квітках кульбаби лікарської, проведено їх кількісний аналіз в сировині по фазах вегетації та в залежності від місць зростання;
- ідентифіковано 48 БАР в листі та квітках кульбаби лікарської;
- розроблено методики стандартизації компонентів надземної та підземної частин кульбаби лікарської для існуючих та потенційних препаратів, виготовлених на їх основі, за вмістом БАР з застосуванням сучасних аналітичних методів;
- розроблено способи одержання екстрактів надземної частини кульбаби лікарської та досліджена їх фармакологічна активність.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладено на III Міжнародній науково-практичній конференції „Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003), науково-практичній конференції з міжнародною участю „Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок” (Тернопіль, 2004), VI Національному з'їзді фармацевтів України (Харків, 2005), Міжнародній науково-практичній конференції „Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів” (Тернопіль, 2006).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць, у тому числі 6 статей (5 із них унаукових фахових виданнях), 2 деклараційних патенти на корисну модель, 7 тез доповідей.
Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, п¢яти розділів експериментальних досліджень, висновків, списку використаних джерел літератури та 14 додатків. Дисертація викладена на 291сторінці машинописного тексту. Обсяг основного тексту 148 сторінок. Дисертаційна робота ілюстрована 41 рисунком і 44 таблицями. Список використаних джерел містить 183 найменування, з них 70 іноземних.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Кульбаба лікарська: ботанічна характеристика, хімічний склад, застосування в медицині (огляд літератури)
В розділі проаналізовані та узагальнені дані первинних джерел з ботанічної характеристики, ареалу розповсюдження, сучасного стану вивчення хімічного складу, використання в науковій та народній медицині надземної та підземної частин кульбаби лікарської. Представлена номенклатура лікарських засобів (ЛЗ), що містять у своєму складі кульбабу лікарську та описані сучасні методи аналізу біологічно активних речовин, що входять до складу кульбаби лікарської.
Дослідження хімічного складу та ідентифікація біологічно активних речовин з надземної частини кульбаби лікарської
Об'єктами дослідження були листя та квітки кульбаби лікарської (TaraxacumofficinaleWigg.), зібрані в фазу масового цвітіння рослини.
В результаті хімічного скринінгу листя та квіток кульбаби лікарської, який проводився загальноприйнятими методами (якісні реакції, ПХ, ТШХ, ВЕРХ, ГРХ), встановлено наявність таких груп БАР, як гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, кумарини, тритерпеноїди, полісахариди, амінокислоти, стерини, жирні кислоти, каротиноїди, токофероли та хлорофіли.
На основі результатів аналізу фізико-хімічних властивостей (даних УФ-, ІЧ-спектрального аналізів, хроматографії, порівняння з вірогідними зразками), даних ВЕРХ та ГРХ хроматографування, встановлена структура 48 речовин. Виділення БАР з листя та квіток кульбаби лікарської проводили за допомогою рідинно-рідинного фракціювання, хроматографії на поліаміді, рехроматографії та дробної кристалізації. Фізико-хімічні властивості речовин, виділених із листя та квіток кульбаби лікарської, представлені в табл. 1.
Флавоноїди. Флавоноїдну природу речовин Ф1, ФГ1, ФГ2, ФГ3 доводили на основі результатів фізико-хімічних досліджень: якісними реакціями, хроматографічним аналізом, даними спектрального аналізу, продуктами гідролізу. В ІЧ-спектрах цих сполук присутні смуги поглинання, характерні для флавоноїдів: в області 3500-2900 см-1 (фенольні гідроксили), 1665-1615 см-1 (карбонільна група γ-пірону), 1640-1450 см-1 (валентні коливання ароматичних кілець).
За рухомістю на хроматограмах в різних системах розчинників, флуоресценції в УФ-світлі, результатами ціанідинової реакції за Бріантом речовину Ф1 віднесли до агліконів, речовини ФГ1, ФГ2, ФГ3 до глікозидів.
Речовину агліконової природи Ф1 було ідентифіковано як 5,7,3',4'-тетрагідроксифлавон (лютеолін).
Монозиди флавоноїдів. В результаті кислотного гідролізу речовин ФГ1, ФГ3 утворювались еквімолярні кількості аглікону, який був ідентифікований як лютеолін, та цукрового компоненту, який хроматографічно ототожнили як глюкозу. З використанням специфічних реакцій та диференційної УФ-спектрофотометрії встановили місце приєднання глюкозидних фрагментів (для речовини ФГ1 біля С-7, для речовини ФГ3 біля С-4'). В ІЧ-спектрах речовин виявляється смуга при 885см-1, що вказує на β-глікозидний зв'язок, три смуги при 1100 – 1010 см-1 характерні для піранозного окисного циклу цукрових залишків.Отже, речовину ФГ1 ідентифікували як лютеолін-7-О-β-D-глюкопіранозид (цинарозид), речовину ФГ3 – як лютеолін-4'-О-β-D-глюкопіранозид.
Диглюкозид флавоноїду. В результаті кислотного гідролізу речовини ФГ2 утворювався аглікон лютеолін та цукрові компоненти, які хроматографічно ототожнили як глюкозу та арабінозу (молярне співвідношення аглікон : цукровий залишок = 1:2). В результаті ступінчатого гідролізу речовини спочатку утворювались цинарозид та арабіноза, потім лютеолін та глюкоза. За допомогою якісних реакцій, УФ- та ІЧ-спектральних характеристик у порівнянні з достовірним стандартом, речовину ФГ2 ідентифікували як лютеолін-7-О-β-D-глюкопіранозил-6-α-L-арабінозид.
Гідроксикоричні кислоти. Речовини ОК1, ОК2, ОК3, ОК4 на хроматографічному папері давали позитивні реакції на фенольний гідроксил (з заліза (ІІІ) хлоридом, діазотованою сульфаніловою кислотою). Кислотні властивості виявлені на підставі утворення синіх плям на ПХ з бромтимоловим синім. При обробці хроматограм реактивом барбітурової кислоти пляма речовини ОК1 давала блакитне забарвлення, що свідчить про наявність у її складі хінної кислоти.
На підставі проведених досліджень і результатів порівняння з вірогідними зразками (температура плавлення, флуоресценція в УФ-світлі, лужна деструкція,
Таблиця 1
Основні фізико-хімічні властивості речовин, виділених та ідентифікованих в листі та квітках кульбаби лікарської
| № п/п | Речовина, її структурна характеристика | Джерело отримання сполуки | Т пл, 0С | УФ-спектр, λmax, нм | Rfу системах розчинників | ||
| Система | Rf | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
| Гідроксикоричні кислоти | |||||||
| 1 | ОК1 Хлорогенова кислота (5-О-кофеїл-D-хінна кислота) | К, Л | 203-205 | 325300245 | 16 | 0,620,67 | |
| 2 | ОК2 Кавова кислота(3,4-дигідроксикорична кислота) | К, Л | 193-195 | 235299235 | 16 | 0,800,50 | |
| 3 | ОК3 п-Кумарова кислота(4-гідроксикорична кислота) | К, Л | 212-214 | 310228 | 16 | 0,910,61 | |
| 4 | ОК4 Цикорієва кислота(2,3-дикофеїлвинна кислота) | К, Л | 194-198 | 325215 | 16 | 0,520,59 | |
| Флавони | |||||||
| 5 | Ф1 Лютеолін (5,7,3',4'-тетрагідроксифлавон) | К | 330 | 350263255 | 13 | 0,780,08 | |
| Глікозиди флавонів | |||||||
| 6 | ФГ1 Цинарозид(лютеолін-7-О-β-D-глюкопіранозид) | К, Л | 240-243 | 350267255 | 1 | 0,41 | |
| 7 | ФГ2 Лютеолін-7-О-β-D-глюкопіранозил-6-α-L-арабінозид | К, Л | 193-196 | 350267255 | 16 | 0,670,40 | |
| 8 | ФГ3 Лютеолін-4'-О-β-D-глюкопіранозид | Л | 189-192 | 340287270 | 12 | 0,690,47 | |
| Цукри | |||||||
| 9 | D-фруктоза | К, Л | 4 | 0,35 | |||
| 10 | L-рамноза | К, Л | 4 | 0,58 | |||
| 11 | D-ксилоза | К, Л | 4 | 0,51 | |||
| 12 | D-арабіноза | К, Л | 4 | 0,45 | |||
| 13 | D-галактоза | К | 4 | 0,29 | |||
| Амінокислоти | |||||||
| 14 | Гліцин* | К, Л | |||||
| 15 | Аргінін* | К, Л | |||||
| 16 | Аланін* | К, Л | |||||
| 17 | Пролін* | К, Л | |||||
| 18 | Валін* | К, Л | |||||
| 19 | Лізин* | К, Л | |||||
| 20 | Ізолейцин* | К, Л | |||||
| 21 | Лейцин* | К, Л | |||||
| 22 | Фенілаланін* | К, Л | |||||
| 23 | Триптофан* | К, Л | |||||
| 24 | Гістидин* | Л | |||||
| 25 | Треонін* | Л | |||||
| 26 | Цистеїн* | К | |||||
| 27 | Тирозин* | К | |||||
| 28 | Метіонін* | К | |||||
| Кумарини | |||||||
| 29 | Ескулетин | К, Л | 5 | 0,51 | |||
| Стерини | |||||||
| 30 | β-ситостерин | К, Л | 8 | 0,6 | |||
| Тритерпеноїди | |||||||
| 31 | β-амірин | К, Л | 7 | 0,46 | |||
| Жирні кислоти | |||||||
| 32 | Міристинова кислота** | К, Л | |||||
| 33 | Пальмітинова кислота** | К, Л | |||||
| 34 | Стеаринова кислота** | К, Л | |||||
| 35 | Олеїнова кислота** | К, Л | |||||
| 36 | Лінолева кислота** | К, Л | |||||
| 37 | Арахінова кислота** | К, Л | |||||
| 38 | Бегенова кислота** | К, Л | |||||
| 39 | Ліноленова кислота** | К, Л | |||||
| 40 | Лігноцеринова кислота** | К, Л | |||||
| 41 | Капронова кислота** | К | |||||
| 42 | Каприлова кислота** | К | |||||
| 43 | Лауринова кислота** | К | |||||
| 44 | Пальмітинолеїнова кислота** | К | |||||
| 45 | Пентадеценова кислота** | К | |||||
| Токофероли | |||||||
| 46 | α-токоферол | К | 9 | 0,56 | |||
| 47 | β-токоферол | К | 9 | 0,32 | |||
| 48 | δ-токоферол | К | 9 | 0,22 | |||
| Примітки:1 – К – квітки кульбаби лікарської;2 – Л – листя кульбаби лікарської;3 – Л, К – речовина в сировині ідентифікована вперше;4 – * – речовина ідентифікована методом ГРХ;5 - ** - речовина ідентифікована методом ВЕРХ.Системи розчинників:№ 1 – н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:2); № 6 – 15 % оцтова кислота;№ 2 – н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:5); № 7 – гексан-етилацетат (6:2);№ 3 – 2 % оцтова кислота; № 8 – гексан-етилацетат (2:1);№ 4 – ацетонітрил-вода (8:2); № 9 хлороформ.№ 5 – етилацетат-льодяна оцтова кислота-мурашина кислота-вода (100:11:11:26); | |||||||
дані УФ- та ІЧ-спектрів, хроматографічна поведінка (ПХ, ТШХ, ВЕРХ) речовини ОК1, ОК2, ОК3 та ОК4 відповідно ідентифіковані з 5-О-кофеїл-D-хінною (хлорогеновою), 3,4-дигідроксикоричною (кавовою), 4-гідроксикоричною (п-кумаровою) та 2,3-дикофеїлвинною (цикорієвою) кислотами.