Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением (стр. 2 из 3)
1.3 Возникновение устойчивого сигнала
Время запаздывания и интенсивность флуоресценции хелатов европия зависят от структуры лигандов и от природы их физического окружения. Для измерения флуоресценции европия с достаточно высокой чувствительностью необходимо разложить комплекс с иммуно-реактивными компонентами. Это достигается понижением рН до 2-3 путем добавления соответствующего буферного раствора. При низких рН различные - дикетоны связывают ионы европия, образуя хелатные соединения с высокой интенсивностью флуоресценции. Для подавления гашения необходимо также исключить воду из микроокружения комплекса. Для этой цели добавляют детергент, который переводит малорастворимый органический комплекс в мицеллярную фазу. Добавление триоктилфосфиноксида в еще большей степени изолирует комплекс в такой мицелле от воды. Этот метод подробно описан в работе и назван DELFIA, т.е. флуоресцентный иммуноанализ с лантанидной меткой, флуоресценция которой усилена за счет диссоциации. Наборы реагентов для проведения такого типа иммуноанализа выпускает фирма LKBWallac.
Отношение сигнал/шум.
Джексон и Экинс теоретически оценили предел чувствительности иммуноанализа. Они показали, что чувствительность неконкурентного иммуноанализа зависит от уровня неспецифического связывания и удельной активности меченого компонента. Другими словами, чем выше специфический сигнал и ниже фон, тем больше теоретическая чувствительность данного метода. Следовательно, применение радиоактивных изотопов налагает определенные ограничения на чувствительность, так как удельная активность метки не может превышать некоторой активности, при которой Метка разрушает иммунореагент. Пока что применение хелатов нтанидов в сочетании с импульсной флуориметрией с разрешением во времени представляется наиболее перспективным путем повышения чувствительности анализа.
Продолжительность измерений и воспроизводимость результатов. Сама природа флуоресценции обеспечивает отсутствие процессов денатурации вещества в ходе измерения, что создает возможность применения импульсной флуориметрии. Продолжительность одного цикла измерений интенсивности флуоресценции с разрешением во времени обычно составляет 1 мс, в том числе фаза запаздывания - 400 мкс; фаза измерения - 400 мкс и Лаг-фаза - 200 мкс. Следовательно, в течение 1 с можно выполнить 1000 измерений и накопить сигнал.
1.4 Флуориметры
Сойни и Койола описали простой флуориметр с ручным управлением, специально созданный для флуоресцентного иммуноанализа с применением хелатов лантанидов. Недавно разработан новый высокочувствительный флуориметр с разрешением во времени Arcus 1230, предназначенный для определения европия. Широкий динамический диапазон этого прибора обеспечивает создание таких методов иммунометрического анализа, которые отличаются не только высокой чувствительностью, но и очень широким диапазоном определяемых концентраций. На этом приборе можно проводить определение хорионического гонадотропина человека в концентрациях от 0,1 до 1000 м. ед. /л. Прибор пригоден для проведения измерений как в пробирках, так и в лунках стрипов.
Подготовка проб и выполнение анализа. Использование стрипов позволяет повысить эффективность работы оператора и увеличить число анализируемых проб. Подготовку проб и выполнение анализа облегчает применение приспособлений для добавления реагентов, встряхивания микропланшетов, автоматической или ручной промывки лунок. Гибкая система математической обработки данных флуориметра Arcus позволяет представлять результаты измерений в нескольких вариантах. Флуориметр пригоден для работы как с серийно выпускаемыми наборами, так и с оригинальными методиками.
Обезвреживание отходов. Все компоненты флуоресцентного иммуноанализа сравнительно безвредны, и их легко можно захоронить.
2. Применение флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением
Определение белков по методу двухсайтового иммуноаналнза. Разработаны методики двухсайтового флуоресцентного иммуноанализа типа DELFIA для определения тироидстимулирующего гормона, хорионического гонад от ропина человека, инсулина, альфа-фетопротеина, поверхностного антигена гепатита В, антител к вирусу краснухи, панкреатической липазы А2 человека, эпидермального фактора роста человека, пролактина.
Мы разработали наборы, выпускаемые в настоящее время в промышленном маштабе, для определения лютеинизирующего гормона и фолликулстимулирующего гормона. Схема метода представлена на рис.2.
Чувствительность и рабочий диапазон концентраций определяемого вещества. Типичная калибровочная кривая и профиль точности для измерения LH представлены на рис.3. Статистическая обработка данных была выполнена с помощью программы MR С Immunoassay.
Точность. Точность определения FSH в одном анализе оценивали путем анализа 10 повторов проб из трех пулов плазмы со средним содержанием гормона: 9,7; 39,8; и 72,0 м. ед/л. Точность определения FSH в различных анализах оценивали путем анализа повторов проб. из четырех пулов плазмы в шести различных анализах. Результаты оценок точности представлены в табл.2.
Разброс результатов. Концентрацию LH в 77 пробах плазмы, отобранных в клинике King'sCollege от пациенток, страдающих бесплодием, определяли методом DELFIA и обычным РИА. Профиль разброса результатов представлен на рис.4. Для более чувствительного метода DELFIA типичны отклонения в отрицательную сторону по сравнению со значениями, полученными методом РИА.
Определение гормонов методом конкурентного иммуноанализа. Сообщалось о применении конкурентного метода DELFIA для определения кортизола и дигоксина. В этом методе определяемое вещество и определенное количество конъюгата гаптен-белок, иммобилизованного на твердой фазе, конкурируют за ограниченное число центров связывания антител, меченных Ей.
На этом же принципе основаны разработанные нами методики анализа DELFIA для прямого определения прогестерона и эстрадиола в плазме периферической венозной крови и эстрон-3-глюкуронида в разбавленных пробах мочи. В качестве иллюстрации на рис.5 представлена схема методики определения концентрации прогестерона.
Чувствительность, точность и рабочий диапазон концентраций определяемого вещества. Типичная калибровочная кривая и профиль воспроизводимости определения прогестерона представлены на Рис.6.
Разброс результатов. Концентрацию прогестерона в пробах плазмы определяли методом DELFIA и обычным методом РИА. Результаты представлены на рис.7. Наблюдающиеся при низких концентрациях отклонения в отрицательную сторону обусловлены завышенными результатами метода РИА; впоследствии они были откорректированы.
Результаты определения прогестерона, полученные методом DELFIA, хорошо согласуются с данными, полученными с применением выпускаемых промышленностью наборов РИА для прямого определения, например Coat-a-Count и NewAmerlex-M.
2.1 Альтернативные методы определения гаптенов
Меченый антиген. Ловгреи описал конкурентный метод определения прогестерона в периферической плазме с помощью нового конъюгата прогестерон-EDTA-Eu. В этом методе используется строго ограниченное количество иммобилизованных на твердой фазе антител, полученных к конъюгату 11а-сукцинил-про-гестерона с БСА.
Меченые антитела. Предложено несколько подходов к разработке иммунометрических методов определения гаптенов.
На рис.8 представлена схема одного из них, включающего несколько стадий неравновесных односайтовых анализов. В соответствующей методике применены моноклональные антитела, меченные аминофенил-EDTA-Eu, и избыток конъюгата 11-сукцинил-прогестерона с тироглобулином быка, иммобилизованного на поверхности пластиковых вкладышей. Вкладыши помещают в лунки стрипов микротитровальных планшетов. Метку измеряют в "свободной" фракции антигена на вкладыше после промывки и удаления остатков биологических образцов. В предварительных экспериментах достигнуты большая чувствительность и лучшая точность, чем в конкурентных методах иммуноанализа.
3. Перспективы развития флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением
Разработка новых методов иммуноанализа. Разработка новых исследовательских методов иммуноанализа затруднена из-за недоступности соответствующего реагента для введения метки. Такие реагенты очень стабильны, а методы получения конъюгатов с использованием этих реагентов очень просты. Выпуск таких реагентов в промышленном масштабе значительно ускорит внедрение методов;: флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением и разработку новых исследовательских методов иммуноанализа.
3.1 Скрининг
Клинические анализы. Аренде и Норгаард-Педерсен изучали возможность применения метода DELFIA для скрининга конгенитального пшотироидизма путем измерения уровня TSH в пятнах крови на фильтровальной бумаге с точки зрения возможности применения в клинической практике н в сравнении с методом РИА. Анализ 19 проб крови новорожденных с конгенитальным гипотироидизмом дал положительные результаты как в DELEIA, так и в РИА. Анализ 3944 проб двумя методами позволил обнаружить конгенитальный гипотироидизм в одной пробе. Как показали повторные анализы, метод DELFIA реже дает ложные положительные результаты и характеризуется лучшей воспроизводимостью как в одном анализе, так и между анализами.