Флуоресцентный иммуноанализ с полным внутренним отражением (стр. 3 из 3)
Во-первых, измерение флуоресценции на пути первичного светового луча обычно более эффективно, чем в перпендикулярном направлении. Во-вторых, измерение флуоресценции на выходе из волновода связано с необходимостью высокоэффективной оптической фильтрации света для отделения света возбуждения от света эмиссии. К тому же испускаемый свет составляет лишь малую долю света возбуждения; поэтому фильтры должны пропускать очень узкую полосу и обладать очень высокой эффективностью пропускания излучаемого света. По нашим данным, удовлетворительную фильтрацию обеспечивают несколько фильтров и последующих решетчатых моиохроматоров. Эту проблему можно было бы частично разрешить с помощью флуоресценции с временным разрешением или флуорофоров с большим стоксовым сдвигом, чем у флуоресцеина. Однако в настоящее время новые флуорофоры с достаточно продолжительным временем свечения еще малодоступны, а специфические свойства не позволяют применять их непосредственно в ПВОФ.
Малодоступны и флуорофоры с большим стоксовым сдвигом, например фикобилипротеины, как и соответствующие эффективные оптические фильтры. Измерение флуоресценции, генерированной в обратном направлении к лучу возбуждения, позволяет исключить эти проблемы, используя легкодоступные реагенты и оптические устройства. Типичная схема такого измерения флуоресценции представлена на рис. 6. В этой схеме свет возбуждения направляется в волновод через дихроичный делитель светового луча. Этот делитель отражает свет возбуждения и пропускает свет эмиссии. Здесь практически полностью подавляется фоновый сигнал света возбуждения, так как последний направляется от детектора.
ПРИМЕНЕНИЕ
Все опубликованные данные о применении ПВОФ в иммуно-анализе суммированы в табл. 2. В общем случае использовались три типа аналитических систем с мечеными реагентами или определяемыми веществами.
| Таблица 2. Применение принципа полного внутреннего флуоресценцией в иммуноанализе | отражения с | ||
| Определяемое вещество | Метка | Волновод | Литература |
| Фенил мышьяковая кислота | Флуоресцеин | Кварцевая пластина | |
| Морфин | То же | ||
| Динитрофенильные | Родамин | N И | |
| группы | |||
| Иммуноглобулин G | Триптофан | N И | |
| Иммуноглобулин G | Флуоресцеин | N N | |
| Иммуноглобулин G | и | Кварцевое волокно | |
| Альбумин | N | То же | |
| Трансферрин | " | ||
| Дигоксин | N | * м | |
| Иммуноглобулин G | й | Стеклянная пластина | |
В первых работах по применению ПВОФ в иммуноанализе использовались меченые реагенты. В этих работах антитела метили флуоресцеином, а гаптены иммобилизовали в виде конъюгата с альбумином на поверхности кварцевой пластины. Количество меченных флуоресцеинизотиоцианатом антител, связавшихся с иммобилизованными гаптенами, определяли с помощью нераспространяющейся волны по возбуждению флуоресценции на границе раздела. Добавление в раствор свободного гаптена уменьшало скорость связывания меченных ФИТЦ антител с иммобилизованным на поверхности гаптеном пропорционально концентрации свободного гаптена. Флуоресценцию измеряли под прямым углом к поверхности. Предел обнаружения составлял 0,2 мкмоль/л морфина.
Близкий подход в сочетании с корреляционной спектроскопией флуоресценции использовал Томпсон. В этом подходе динитрофенол иммобилизовали на альбуминовой подложке на поверхности кварцевой пластины и изучали реакцию моновалентных и бивалентных антител, меченных родамином, с динитрофенолом.
В наших лабораториях создана система иммуноанализа с применением избытка меченого реагента. В этой системе использована тщательно отработанная двухсайтовая методика иммунофлуоро-метрического анализа, согласно которой иммобилизованные антитела первоначально инкубируют с раствором антигена в течение 15 мин. После отмывки биологической жидкости буферным раствором в систему добавляют вторые специфические антитела, меченные ФИТЦ, и изучают ход реакции с антигеном, иммунологически иммобилизованным на границе раздела. В некоторых случаях несвязанные белки, меченные ФИТЦ, удаляют путем отмывки буферным раствором и измеряют флуоресценцию связанного комплекса. Волновод с нанесенными на него антителами можно использовать повторно после промывки поверхности разбавленной НС1, которая разрушает иммунные комплексы.
На рис. 7 представлены типичные временные характеристики выходного сигнала системы; здесь же схематично объяснены основные этапы анализа. Флуоресценцию измеряли как под прямым углом к поверхности, так и параллельно первичному световому лучу на выходе волновода, в качестве которого применяли и пластины, и волокна. С помощью этой системы были определены оптимальные состав буферного раствора и угол падения светового луча.
В этом анализе на поверхность волновода наносят антитела против IgG человека. Иммобилизованные антитела реагируют со стандартным раствором IgG, а затем с анти-IgG, меченными ФИТЦ; ход последней реакции контролируют флуориметрически параллельно первичному лучу возбуждения. Здесь А - волновод с иммобилизованным конъюгатом; Б - сигнал, генерируемый несвязанным ФИТЦ-анти-IgG в слое проникновения нераспространяющейся волны; В - кривые связывания ФИТЦ-анти-IgG в присутствии и в отсутствие антигена; Г - вымывание несвязанных веществ, после которого остаются сигналы специфически и неспецифически связанных реагентов; Д - разрушение иммунных комплексов разбавленной кислотой.
ОБСУЖДЕНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ
Для того чтобы иммуноанализ на основе нераспространяющейся волны нашел применение в клинической практике, он должен удовлетворять ряду требований; эти требования детально обсуждены в работах. В целом эти требования связаны с необходимой в настоящее время или в будущем чувствительностью методик анализа, типом применяемых анализов, необходимой быстротой получения результатов анализа, а также доступностью оборудования и реагентов.
В принципе чувствительность и специфичность иммуноанализа очень высоки. Дальнейшее развитие метода EVIA будет связано с решением, во-первых, общих проблем иммуноанализа, характерных для любого метода, и, во-вторых, специфических только для EVIA задач. Например, в обычном твердофазном иммуноанализе необходимая кинетика реакций достигается за счет оптимизации реагентов и методов введения в них метки, подбора наилучших условий проведения анализа, нахождения адекватных качества и количества иммобилизованных реагентов, подбора других характеристик аналитической системы. Кроме того, применение в качестве меток флуорофоров требует изучения таких факторов, как квантовый выход, стабильность к действию света, стоксов сдвиг, рассеяние света и тушение флуоресценции пробой. Точно так же при конструировании флуориметра необходимо выбрать оптимальные фильтры и детекторы, оптимизировать аккумуляцию света и уменьшить фоновый сигнал. В методе EVIA важны и другие факторы, связанные с характеристиками и функцией волновода. К числу таких факторов относятся эффективность освещения всей сенсорной поверхности волновода и эффективность аккумуляции флуоресценции, генерируемой на границе раздела.
В качестве примеров различных подходов к решению указанных и ряда других задач в табл. 3 приведены характеристики трех из множества выполняемых в настоящее время проектов. Три исследовательские группы представили принципиальные схемы волноводов и связанных с ними проточных кювет; во всех проектах измеряется флуоресценция, генерируемая нераспространяющейся волной.
В первом проекте плоский волновод является частью прямоугольной кюветы. Реагент иммобилизуется на внутренней поверхности волновода, а пробу вводят через щель в крышке кюветы, которая определяет ее объем. Свет возбуждения направляют на это устройство через клинообразную призму, установленную на конце волновода. Флуоресценцию измеряют со стороны входа света в волновод. Эта система имеет ряд достоинств, из которых не последнее место занимает относительная простота ее изготовления.
Во втором проекте используется кварцевый волоконный волновод; его можно поместить в капилляр, позволяющий быстро ввести определенный объем пробы. Реагенты иммобилизуют на поверхности волокна, а флуоресценцию измеряют со стороны входа света. Эта система характеризуется высокой чувствительностью, обусловленной многократным внутренним отражением. Применение более тонкого и более длинного волновода повышает чувствительность пропорционально числу отражений понятие о волоконнооптических сенсорах на основе эффекта полного внутреннего отражения существенно расширено; здесь упоминаются пять принципиально различных типов сенсорных устройств. В четырех из них используется явление нераспространяющейся волны. Указанные типы сенсорных устройств схематично изображены на рис. 11; там же объяснены принципы их действия. Можно достаточно обоснованно предположить, что в ближайшие годы появятся и другие, принципиально иные, типы устройств на основе эффекта полного внутреннего отражения и что такие устройства займут важное место не только в медицине, но и в ряде других областей, где необходимы быстродействующие аналитические системы, например в управлении непрерывными процессами и в лабораториях обеспечения качества.