Хіміко-токсикологічне дослідження лікарського препарату "Тетлонг-250" (стр. 6 из 8)
Відомі хімічні методи якісного і кількісного визначення дисульфіраму є нечутливі, тому придатні лише для дослідження його в лікарській формі і аж ніяк не відповідають вимогам токсикологічного аналізу.
Метою даного дослідження є завдання розробити чутливий, достатньо точний і простий метод ідентифікації та кількісного визначення дисульфіраму в біологічних середовищах і тканинах організму. Тому для досягнення поставленої мети нами було вирішено дослідити можливість і умови утворення комплексних сполук цього препарату та його основного метаболіту - диетилдитіокарбамінової кислоти з катіонами важких металів.
Нами перевірені деякі методики [34] утворення комплексів дисульфіраму і його метаболіту з катіонами важких металів, проте в літературі [] не знайдено точних даних отримання індивідуальних речовин - комплексних сполук саме дисульфіраму. Навпаки, і це доводять наші дослідження, що процес комплексоутворення відбувається не з самим дисульфірамом, а з його метаболітом - диетилдитіокарбаміновою кислотою, яка є відновленою формою препарату:
| С2Н5 | N-C | S | Me | S | C-N | С2Н5 |
| С2Н5 | S | S | С2Н5 |
І дійсно наші припущення повністю підтвердились після серії проведених експериментів на предмет утворення комплексних сполук, як з самим дисульфірамом, так і методами зустрічного синтезу цих сполук з послідуючим порівнянням їх властивостей.
Дослідження показали можливість утворення комплексних сполук з катіонами важких металів саме з відновленою формою дисульфіраму - диетилдитіокарбаміновою кислотою, на дві молекули якої і ділиться досліджуваний препарат внаслідок розриву зв’язку -S-S-:
| С2Н5 | N-C-S-S-C-N | С2Н5 | 2H+ | 2 | С2Н5 | N-C-SH |
| С2Н5 |  С2Н5 | С2Н5 | ||||
| S S | S |
Комплексні сполуки з катіонами важких металів, отримані нами безпосередньо при взаємодії водно-спиртових розчинів солей важких металів з дисульфірамом та окремо добутих шляхом зустрічного синтезу, а саме - взаємодією солей цих металів з диетилдитіокарбамінатом натрію, за даними їх фізичних властивостей та елементного аналізу свідчать про їх абсолютну ідентичність [65, 66]. Паралельно з цим, за даними хроматографії в тонкому шарі сорбенту виявлено і доведено, що дисульфірам, як індивідуальна речовина, з солями важких металів не взаємодіє. З цими солями в розчинах взаємодіє диетилдитіокарбамінова кислота, на дві молекули якої і розпадається дисульфірам в кислотному середовищі (див. реакцію вище!) [67].
Таким чином, цей факт дозволяє стверджувати, що, як в живому організмі, так і в біологічних середовищах його (кров, сеча) дисульфірам визначається цим методом лише за реакцією його основного метаболіту - диетилдитіокарбамінату, що підтверджується спектрофотометричними дослідженнями та припущеннями інших авторів [51, 53, 60].
Однак, дотепер остаточно ще і не з’ясовано, на якій стадії метаболізму в організмі дисульфірам проявляє свої цінні антиалкогольні та антинаркотичні властивості: на стадії перебування в рідинах організму у незмінному стані хімічної структури, чи на стадії розпаду до диетилдитіокарбамінату, бо, наскільки відомо, останній не має фармакологічних властивостей дисульфіраму.
Паралельно нами проводилось дослідження стабільності розчинів утворених комплексних сполук в часі. З цією метою в ряд мірних пробірок вносили по 5 мл 10мг% спиртових розчинів диетилдитіокарбамінату натрію і окремо - дисульфіраму. Опісля додавали в окремі пробірки по 0,2 мл 0,5% водних розчинів солей: срібла нітрату, міді хлориду, паладію хлориду, нікелю хлориду, вісмуту нітрату та кобальту хлориду і загальний об’єм пробірок доводили етанолом до 10 мл. Під час постійного збовтування через кожні 10 хв. визначали оптичну густину D розчинів на ФЕКу при відповідних світлофільтрах, у яких знаходяться максимуми вбирання утворених комплексних сполук. Розчином порівняння був етиловий спирт, до якого було додано по 0,2 мл 0,5% водних розчинів вищеназваних солей. Таким чином було експериментально визначено час від моменту утворення комплексних сполук до досягнення найвищого значення оптичної густини D і найдовшої її стабільності в часі. При цьому встановлено, що найбільшу стабільність в часі вони мають в кислому середовищі (рН = 1 - 6,5), а найбільшу оптичну густину досягають при нагріванні розчинів навіть до +50°С (у випадку утворення комплексів з Cu2+ і Ag+) та до +70°С при утворенні комплексу з Со (СlО4) 2. Однак, таке досить високе підвищення температури розчинів є недопустимим при проведенні їх оптичних досліджень. Тому для ідентифікації і кількісного визначення дисульфіраму у вигляді його метаболіту диетилдитіокарбамінату нами було вибрано і запропоновано комплекс його з Pd2+, який утворюється (досліджено нами!) в звичайних умовах з достатньою для дослідження інтенсивністю і стабільністю в часі.
Отримані комплексні сполуки і їх властивості представлені в таблиці 1.
2.2 Ідентифікація "Тетлонгу-250" за допомогою методу хроматографії в тонкому шарі сорбенту
Метод хроматографії в тонкому шарі собренту (ХТШС) вперше був запропонований в 1938 році Н.А. Ізмайловим та М.С. Шрайбер. На пластинках, покритих тонким шаром оксиду алюмінію, вони розділили алкалоїди, виділені з лікарських рослин.
Теоретичні основи методу хроматографії в тонкому шарі сорбенту описані в ряді монографій, статей і оглядів (Шталь Е., 1965; Шаршунова М., Шварц У., Михалець Ч., 1980; Пул К.Ф., Хатіб С., 1990 та ін), в яких висвітлені способи застосування методу ХТШС для розділення, ідентифікації і кількісного визначення органічних і неорганічних речовин [21, 52, 54].
Завдяки великій розділяючій здатності, високій чутливості і швидкості розділення метод ХТШС став важливим методом ідентифікації токсикологічно важливих речовин у витяжках з біологічного матеріалу та біологічних рідин (В.П. Крамаренко, 1989) [19, 20]. При дослідженні витяжок з біологічного матеріалу (кров, сеча, органи трупа) неможливо здійснити ідентифікацію речовин за допомогою хімічної реакції без попередньої очистки, бо цьому будуть заважати невідомі домішки білкової і ліпідної природи. А при ідентифікації речовин з допомогою методу ХТШС повністю виключається вплив цих домішок на результати досліджень, тому ці витяжки можна досліджувати без попередньої очистки [61, 62, 63, 64].
В зв’язку з цим ми вирішили застосувати цей метод для ідентифікації і кількісного визначення "Тетлонгу-250" за його основним діючим агентом - дисульфірамом у біологічному матеріалі (крові, сечі) у вигляді комплексу його метаболіту - диетилдитіокарбамінату з Pd2+.
Для дослідження було використано готові пластинки "Силуфол-UV-254" з готовим закріпленим шаром силікагелю в суміші з люмінісцентним індикатором. Хроматографування проводилось в камерах висотою 20 см і діаметром 10 см, які заповнювались і насичувались 1 год. парами елуента такого складу: метанол, етанол, триетаноламін (1: 1: 0,3). На умовну лінію старту пластинки, що знаходилась на відстані 2 см від її нижнього краю, наносили з допомогою капілярів по дві краплі етанольно-водних розчинів: чистого дисульфіраму, а через 1,5 см (на умовній лінії старту) окремо розчини утворених комплексних сполук дисульфіраму з металами, наведеними в таблиці 1. Пластинку підсушували на повітрі і опускали вертикально в камеру для хроматографування, слідкували, щоб фронт елуента не досяг верхнього краю пластинки менше 1 см. Опісля її виймали з камери і ще вологою розглядали в УФ-світлі. На вологій хроматограмі відразу виявлялась пляма темно-сірого кольору дисульфіраму з Rf = 0,91, а плями відповідних "його комплексів з металами" виявлялись лише на висушеній пластинці після довгого (» 5 хв) прямого насвітлення її УФ променями з відповідними величинами Rf, наведеними в таблиці 1.
Таким чином, з допомогою методу ХТШС нами виявлено і доведено, що безпосередньо дисульфірам не утворює сполук з катіонами металів, а лише його метаболіт - диетилдитіокарбамінат, який має інше значення Rf в порівнянні з дисульфірамом. Однак, сам диетилдитіокарбамінат на хроматографічній пластинці в УФ-світлі, на відміну від дисульфіраму, виявляється у вигляді плям з слабкою рожево-фіолетовою флуоресценцією.
2.3 Кількісне визначення "Тетлонгу-250" фотоколориметричним методом
2.3.1 Наукове обґрунтування і розробка методу
Сучасний рівень розвитку науки вимагає використання високочутливих методів аналізу, які дозволяють визначати мікрокількості досліджуваних речовин. Тому широкого застосування набули оптичні методи аналізу, які базуються на взаємодії променевої енергії з аналізуючою речовиною. До цих методів належать фотометричні методи (спектрофотометрія і фотоелектроколориметрія).
Метод спектрофотометрії базується на вибірковому вбиранні монохроматичного випромінювання у видимій, ультрафіолетовій та інфрачервоній ділянках спектру. Вибірковий характер вбирання світла залежить від природи речовини, що дозволяє проводити її якісний і кількісний аналіз.
Цей метод також використовується у фармації, зокрема у фармацевтичному та в хіміко-токсикологічному аналізах, оскільки в ньому повністю реалізується закон Бугера-Ламберта-Бера [3, 4, 5, 7, 15, 22, 40, 48, 56].