Врачу-эндоскописту, направляющему биоптаты на гистологическое исследование, следует помнить о тщательной маркировке материала (с указанием на пробирке фамилии больного и номера истории болезни). Также необходимо правильно заполнять бланк направления материала на гистологическое исследование: помимо паспортных данных больного, номера истории болезни, предполагаемого или установленного диагноза, следует сообщать клинические данные, длительной соблюдаемой безглютеновой диеты, локализацию места взятия биоптата, а также результаты эндоскопического исследования.
Полученный биоптат (или биоптаты) следует сразу же поместить в емкость с фиксатором. По мнению большинства исследователей, для “рутинной” обработки материала более всего подходит 10% процентный раствор нейтрального формалина. Материал в нем фиксируется на протяжении 24 ч.
Перед тем как начать приготовление блока для получения гистологических срезов, очень важно правильно ориентировать биоптат - в противном случае неправильное положение плоскости среза будет причиной возникновения больших трудностей в оценке состояния слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. Так, тангенциальный срез может исказить представление о наличии или отсутствии атрофии ворсинок, создать ошибочное представление о величине соотношения длины ворсинки и глубины крипты. Продольное направление среза вообще не даст возможности оценки большинства морфологических характеристик исследуемой ткани.
Из полученного блока приготавливаются гистологические срезы толщиной 5-6 мкм. После срезы можно окрашивать различными способами. Основной обзорной (и морфометрической) является окраска гематоксилином и эозином. По методу, предложенному Ван Гизон, производится окраска коллагеновых волокон – метод позволяет более точно определять степень выраженности фиброза стромы собственной пластины. Бокаловидные клетки очень хорошо выявляются с помощью окрашивания гистологических срезов альциановым синим. Для определения возможной бактериальной инвазии и лучшей визуализации некоторых отдельных тканевых и структурных компонентов слизистой, удобно применять окраску тканей азуром и эозином (например, по Романовского-Гимза).
Окрашенные препараты, заключенные в полистирол и покрытые покровными стеклами, можно исследовать в световом бинокулярном микроскопе при различном увеличении (комбинации окуляров х7, х10, х15 и объективов х10, х40, х90 МИ создают возможность увеличения от х70 до х1350 - соответственно отдельным комбинациям).
Для определения метрических характеристик исследуемого материала используется стандартная микроскопическая окулярная шкала (100 делений в окуляре х7). Для вычисления площадей применяется квадратная морфометрическая сетка (большой квадрат, разделенный на 256 /16х16/ малых квадратов; в окуляре х10). Подсчет клеток (стромальных и клеток инфильтрата) производится в специальном морфометрическом квадрате с “опорными” точками (встроенном в окуляр х15). Относительная цена деления окулярной шкалы и параметры морфометрических сетки и квадрата при различных увеличениях определялись с помощью объект-микрометра проходящего света (ОМП). Действительная длина шкалы ОМП равняется 1 мм и разделена на 100 делений (с действительной ценой одного деления, равной 0,01 мм).
При гистологическом исследовании и морфометрических подсчетах определяются (в мкм):
а) толщина слизистой оболочки (от собственной мышечной пластинки слизистой оболочки до верхнего края клеток всасывательного эпителия верхушек ворсинок),
б) длина ворсинки (от ее основания до верхнего края),
в) максимальная толщина ворсинки (по верхним краям эпителиоцитов боковых поверхностей ворсинки),
г) глубина крипты (от наружного края устья, до ее дна – по базальной мембране),
д.) ширина крипты (по верхним краям эпителиоцитов).
Указанные измерения производятся в нескольких местах (от 5 до 15, в среднем на 6-7 участках), определяются максимальные и минимальные параметры с последующим вычислением средних величин. Подсчитываются соотношения “средняя длина ворсинки: средняя глубина крипты” и “средняя длина ворсинки: средняя толщина ворсинки”. Обращается внимание на наличие ворсинок необычной формы, крупных уплощенных участков вместо ворсинок, а также на ширину промежутков между ворсинками.
В собственной пластинке в нескольких местах на стандартной площадке (морфометрический квадрат с “опорными” точками) подсчитывается количество:
а) лимфоцитов,
б) плазматических клеток,
в) эозинофильных лейкоцитов,
г) нейтрофильных лейкоцитов,
д.) клеток стромы (фибробластов и фиброцитов) с последующим вычислением средних показателей и пересчетом определяемых величин на стандартную площадь, равную 1 мм2.
Количество межэпителиальных лимфоцитов и бокаловидных клеток подсчитывается среди клеток покровного эпителия ворсинок и отдельно среди эпителиоцитов крипт на различном протяжении их поверхности, с последующим пересчетом на единицу длины поверхности, равную 1 мм.
Измеряется минимальная, максимальная и средняя высота (в мкм) клеток всасывательного эпителия ворсинок, эпителиоцитов крипт, клеток эпителия дуоденальных желез.
Учитывается наличие в строме собственной пластинки слизистой лимфоидных фолликулов и их количество, их величина и состояние светлого (герминативного) центра.
Обращается внимание на состояние стромы слизистой оболочки: оценивается степень выраженности полнокровия сосудов микроциркуляторного русла, лимфатических сосудов, отек, а также наличие или отсутствие кровоизлияний.
Основными морфологическими критериями глютеновой энтеропатии являются следующие изменения, наблюдаемые в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки:
а) уплощение клеток всасывательного эпителия, покрывающих ворсинки, с нарушением полярности их ядер, истончение их щеточной каемки; подобные изменения эпителиоцитов одни из первых исчезают при проведении курса безглютеновой диеты при действительно имевшейся целиакии;
б) атрофия слизистой оболочки с умеренным ее истончением и выраженным в различной степени (у некоторых больных – до субтотального) укорочением ее ворсинок;
в) углубление крипт (признак гиперрегенераторной атрофии);
г) за счет выраженных укорочения ворсинок и углубления крипт резко изменяется величина соотношения “длина ворсинок : глубина крипт”;
д.) увеличивается количество межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ), среди которых, чаще чем обычно, можно наблюдать появление клеток с фигурами митоза; в строме собственной пластины слизистой оболочки кишки наблюдается выраженная лимфоцитарно-плазмоцитарная инфильтрация с наличием значительного количества эозинофильных лейкоцитов
Диагноз целиакии и стадия глютеновой энтеропатии устанавливаются в соответствии с классификацией M. Marsh (1995), который выделил 4 типа изменений слизистой оболочки тонкой кишки при этом заболевании.
I стадия – инфильтративная, характеризуется выраженной инфильтрацией эпителия; строение слизистой оболочки полностью сохранено и мальабсорбция отсутствует; подобные картины могут наблюдаться также у некоторых больных герпетиформным дерматитом и у 25% родственников 1-й степени больных целиакией.
II стадия – гиперпластическая; к лимфоцитарной инфильтрации эпителия ворсинок и крипт присоединяется заметное удлинение крипт.
III стадия – деструктивная, соответствует классической картине целиакии.
IV стадия – гипопластическая или атрофическая; в этой стадии, в отличие от других, морфологические изменения кишки являются необратимыми; их находят при рефракторной целиакии и при энтеропатии, ассоциированной с лимфомой.
Несмотря на то, что гиперрегенераторная атрофия различной степени выраженности, значительная инфильтрация стромы и многочисленные межэпителиальные лимфоциты (МЭЛ) почти всегда свидетельствуют о наличии целиакии, после проведения светооптического исследования в патологоанатомическом заключении все же правильнее говорить о “хроническом (атрофическом) дуодените (или еюните)” и о том, что “наблюдаемая морфологическая картина может иметь место при (или соответствует, или не исключает наличия той или иной стадии) целиакии”; в подобных ситуациях надо рекомендовать повторную биопсию после проведенной терапии безглютеновой диетой. Если в повторном биоптате появятся ворсинки, приближающиеся по строению к нормальным, или хотя бы уплощенный эпителий ворсинок становится высоким, морфолог вправе в своем заключении называть уже более конкретизированный диагноз (“целиакия”).
Более точной морфологической диагностике глютеновой энтеропатии способствуют современные иммуногистохимические (ИГХ) методики (с использованием ИГХ наборов, выпускаемых зарубежными фирмами-изготовителями лабораторных реактивов: “DAKO”, “SIGMA” и т. д.), позволяющие с высокой степенью точности определять в исследуемых тканях клетки инфильтрата стромы и МЭЛ разных клонов, степень созревания и дифференцировки тканевых элементов, интенсивность пролиферации клеток, наличие различных факторов, антигенов и т. п.
Предложена новая схема скрининга, основанная на определении IgA-AtTG, если имеется IgA-дефицит, определяется только IgG-AtTG. В скрининг включена МЭЛ-лимфограмма, которая учитывает и клинический результат исключения глютена и глютеновую нагрузку после гистологического подтверждения глютеновой энтеропатии. Если МЭЛ-лимфограмма показывает нормальные значения для γδ-межэпителиальных Т-лимфоцитов и межэпителиальных NK-лимфоцитов, это имеет высокую отрицательную прогнозирующую ценность — 95% против наличия целиакии. Единственная биопсия теперь считается достаточной для подтверждения диагноза. Учитывая большую распространенность целиакии в популяции в целом и огромное количество больных целиакия-ассоциированными заболеваниями, такими как инсулинозависимый сахарный диабет, остеопороз, анемия, различные дефекты развития, эндокринные нарушения т.д., можно говорить о высокой социальной значимости своевременной диагностики целиакии. Кроме того, целиакия, даже клинически не выраженная, предрасполагает к другим аутоиммунным заболеваниям. Риск интестинальной лимфомы и других гастроинтестинальных новообразований возрастает, если болезнь не лечится. На безглютеновой диете активность ассоциированных заболеваний снижается. Подводя итог вышесказанному, для широкого скрининга групп риска, диагностики и контроля лечения целиакии рекомендуются тесты определения антител классов А и G к тканевой трансглутаминазе и глиадину фирмы «ORGENTEC».