Кинетика и механизм электроокисления типичных токсинов исследовались на стационарных, вращающихся и вибрирующих гладких и платинированных платиновых электродах путем прямого сопоставления поляризационных и адсорбционных измерений, вмыполненных в одних и тех же условиях по методике подробно описанной ранее. Была изучена адсорбция и анодное окисление типичных эндогенных субстратов: билирубина, холестерина, мочевины и глюкозы и типичных ксенобиотиков: производных барбитуровой кислоты, этанола; метанола, формальдегида, фенола и некоторых других.
В качестве основного вещества для изучения режимов работы аппарата, имитирующего детоксицирующую функцию печени с помощью электрохимического окисления, был выбран билирубин, так как реакция его окисления в микросомах печени хорошо изучена и легко контролируется визуально и спектрофотометрически. Растворы билирубина готовились по методике, описанной в работе, и в них добавлялось 150 мМ NaCl. Концентрация билирубина в растворе определялась спектрофотометрически (с использованием калибровочной кривой Био-латест билирубин) на приборах Spec-tromom 402 и Spectromom 410 (Венгрия). Для спектрофотометрического определения билирубина использовались две длины волны — 430 н 480 нм. Все пробы для спектрофотометрического определения билирубина разводились в 30 раз фосфатным буфером. В нескольких сериях записывались абсолютный и дифференциальный спектры билирубина на приборе Uni-сагл-8000 (Cambridje, Англия) в пределах длин волн 350 — 550 нм. Так как билирубин самоокисляется на свету и это может повлиять на данные экспериментов, проводились контрольные опыты для исключения этого эффекта на результаты исследований.
Одновременно с определением концентрации билирубина ставились опыты на острую токсичность на мышах с блокадой РЭС по методике, описанной в работе.
Стендовые опыты проводились как на модельных растворах билирубина, так и на плазме детей, больных гомолитической болезнью новорожденных.
На интактных животных (всего 54 беспородных собак весом от 6 до 13 кг) была проведена серия экспериментов для выяснения влияния электрохимического окисления на нормальные показатели гомеостаза (26 животных) и на скорость выведения билирубина из организма (14 животных + 14 животных в контрольной группе). У собак под гексеналовым наркозом катетеризировалась бедренная артерия и вена и по артерио-венозному контуру подключался аппарат электрохимического окисления (аппарат и магистрали подвергались предварительной силиконизации). Перед началом перфузии животным вводили гепарин фирмы Рихтер из расчета 500 ед/кг веса животного. Кровь из артерии поступала в реакционную ячейку и затем самотеком возвращалась в бедренную вену. Окисление проводили в течение 2 ч при скорости потока крови через электролизер 50 мл/мин. Морфологические показатели крови исследовались до начала окисления и через 15, 30, 60 и 120 мин окисления. Пробы брались из бедренной вены. Производился подсчет эритроцитов, лейкоцитов, определение развернутой лейко-граммы, содержания гемоглобина, гемокрит свободного гемоглобина плазмы. Одновременно изучались биохимические параметры крови на аппаратах Centribichem-400 и 12- и 6-каналь-ных анализаторах SMACAutoanalyserSystem, Техникон (США). Кислотно-щелочное состояние и газовый состав крови исследовались на аппарате микроаструп АВС-2 RadiometerCopenhagen. На 7 собаках изучалось состояние свертывающей системы крови в процессе электрохимического окисления. Определяли количество тромбоцитов, время рекальцификации, толерантности крови к гепарину, тромбопластиновое время по Квику, концентрацию фибриногена. На тромбозластографе Хеллиге (ФРГ) регистрировались тромбоэластографические кривые. Изучалась хемилюминесценция сыворотки крови. Регистрация показателей состояния центральной и периферической гемодинамики в процессе электроокисления осуществлялась на аппарате Mingograph 82 SiemensElema (ФРГ). После окончания экспериментов животные были забиты для гистологических исследований.
2. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ В МОДЕЛИРОВАНИИ ФУНКЦИИ МОНООКСИГЕНАЗ ПЕЧЕНИ
С точки зрения электрохимии возможны три подхода в моделировании функций монооксигеназ печени.
Первое направление — это катодное гидромксилирование за счет двухэлектронного восстановления кислорода, растворенного в крови, на подходящем катоде с поставкой электронов от внешнего источника тока по общему уравнению:
О2+ 2H+ + 2e + RH → ROH + H2O. (1)
При этом механизм протекающих процессов может быть очень сложен. Электрод может выступать как замена окислительно-восстановительной ферментной цепи, поставляющей на фермент Р-450 электроны, необходимые для активации молекулярного кислорода, или обеспечить дополнительную электрохимическую активацию молекулярного кислорода, ускоряя работу микросомальной гидроксилирующей системы. На электродах из различных углеродистых материалов, золота и некоторых других в результате двухэлектронного восстановления кислорода будет образовываться перекись водорода, которая может принимать участие в различных реакциях окисления токсинов, катализируемых ферментами в крови.
Второе направление — это прямое анодное окислительное гидроксилирование различных токсинов по общей реакции:
RH + 2OH— → 2e → ROH + H2O. (2)
Путем увеличения анодного потенциала и правильного подбора материала электрода катализатора можно добиться окисления практически любого органического соединения. Поэтому на сегодняшний день это направление является наиболее перспективным в моделировании функции монооксигеназ печени и полностью независимым от работы ферментативных систем.
Третье направление — это электрокаталитическое гидроксилирование в короткозамкнутом топливном элементе, на катоде-катализаторе которого происходит восстановление растворенного в крови кислорода, а на аноде-катализаторе окисление (гидроксилирование) по реакции (2). Так как между катодом и анодом происходит обмен электронами, суммарная реакция, протекающая в таком топливномливном элементе, следующая:
2 RH + O2 → 2 ROH
В принципе, это наиболее идеальная система в моделировании функции монооксигеназ печени, так как она не требует притока электронов извне (т. е. не требует внешнего источника тока) и является саморегулирующейся системой. Однако большинство ксенобиотиков и токсинов даже на наиболее активных платиновых электродах-катализаторах окисляется с трудом, при достаточно положительных потенциалах. В тоже время на на менее активных из известных в настоящее время кислородных электродах энергетические потери составляют 0,2—0,3 В. Таким образом современное состояние электрокатализа не может обеспечить на известных катализаторах окисление с достаточной скоростью всех токсинов в таких короткозамкнутых топливных элементах. Поэтому основное внимание было сосредоточено на моделировании монооксигеназ печени прямым электрохимическим окислением.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования показали возможности электрохимического окисления в моделировании функции монооксигеназ печени, а также в создании электрохимической модели монооксигеназной системы печени. Изучение электрохимического окисления различных токсинов эндогенного происхождения и ксенобиотиков как на стендах, так и на животных показало, что продукты электроокисления идентичны тем, которые образуются при окислении токсинов в печени. Возможность создания искусственных систем, способных осуществлять гидроксилазные реакции, протекающие в эндоплазматическом ретикулуме клеток печени, лимитируется не собственно возможностями электрохимического окисления токсинов, а проблемой белковой защиты, т. е. связыванием токсина альбумином в организме и проблемой совместимости электрохимической ячейки с кровью. Поэтому все предложенные ранее системы оказались неработоспособными в крови и других биологических жидкостях. Подробное изучение электрохимического окисления различных токсинов прямо в крови, и других физиологических жидкостях, исследования совместимости электрохимической ячейки с кровью позволили создать искусственную детоксицирующую систему клинического назначения.
Так как создание электрохимической модели монооксигеназной системы печени столкнулось с серьезной проблемой совместимости электрохимической ячейки с кровью, был предложен метод непрямого электрохимического окисления крови с использованием переносчиков активного кислорода, когда кровь не вступает в контакт с электрохимической системой, т. е. электролизу подвергается раствор переносчика кислорода, который затем вводится пациенту.
В качестве наиболее удобного и физиологического переносчика кислорода использован изотонический раствор хлористого натрия, в котором при электролизе на подходящих анодах происходит накопление активного кислорода в виде гипохлорита натрия. Показано, что среди реакций окисления гипохлоритом имеются почти все типы реакций катализируемых моноок-сигеназами. Окисление ряда ксенобиотиков и эндотоксинов гипохлоритом приводит к образованию конечных продуктов, аналогичных получаемым с участием цитохрома Р-450. Гипохлорит натрия позволяет обойти эффект белковой защиты токсичных метаболитов и моделирует не только функции монооксигеназ печени, но и молекулярные механизмы фагоцитоза.