Было изучено два режима низкоинтенсивного лазерного излучения (постоянная и переменная генерацию импульса). Для проведения экспериментальных исследований был использован лазерный излучатель «МУСТАНГ-2000» (НПЛЦ «Техника», г. Москва). В серии опытов, в аналогичных условиях выделенные из крови доноров нейтрофилы подвергали лазерному облучению суспензию, температура взвеси нейтрофилов составила 370C. Для проведения ЛО нейтрофилов в силиконизированную кювету со светоизолированными стенками вносился 1 мл раствора Хенкса, содержащего 105 нейтрофилов. Клетки облучали сверху при постоянной длине волны 0,63 мкм, поскольку по данным С.В Москвина (2004) длина волны 0,63 мкм соответствует на ионном уровне зоне адсорбции основных метаболитов НГ в световом спектре излучения лазера (Ben-HerE., 1993). Доза облучения взвеси нейтрофилов, рассчитанная с учётом частоты следования импульса от 20 до 2500Гц лежала в интервале значений 0,0018-1,1Дж\см2. Время экспозиции 5-ти кратно увеличивалось-30 сек, 2,5 мин, 12,5 мин. Интактные нейтрофилы подвергали темновой инкубации при аналогичных условиях, но без ЛО.
Для исследования функциональной активности НГ интактных и облучённых лазером с постоянной и переменной генерацией импульса, биохимических особенностей супернатантов нейтрофилов были использованы иммунологические методы: определение лизосомальной фагоцитарной, активности нейтрофилов по НСТ-тесту, и биохимические методы - исследование активности НАДФ-оксидазы нейтрофилов, цитокинового профиля, содержания макроэлементов и глюкозы в супернатантах нейтрофилов.
Анализ дозозависимых эффектов действия ЛО с переменной генерацией импульса показал стимулирующее влияние излучений при длине волны 0,63 мкм, частоте 100 Гц, и дозой воздействия 0,56Дж\см2. При данных параметрах нами отмечено максимальное усиление факторов кислородзависимой микробоцидной системы и фагоцитарной активности НГ. Лизосомальная активность нейтрофилов в ответ на стимуляцию лазером при повышении дозы излучения с от 0,0018 Дж\см2 до 0,56Дж\см2 снижалась; наблюдаемый процесс связан с тем, что активированные лазером нейтрофилы частично или полностью утрачивают свои гранулы, подвергаются дегрануляции или экзоцитозу, что не противоречит данным А.И. Козеля и Г.К. Попова по данной проблеме (Козель А.И., Попов Г.К., 2000) (таблица 1).
Поскольку наряду с ЛО при переменных воздействиях также используются излучения с постоянной генерацией импульса, следующей задачей исследования было изучение влияния дозы, времени экспозиции лазерного излучения с постоянной генерацией импульса на функциональную активность нейтрофилов донорской крови.
По мнению С.В.Москвина данный вид излучения обладает не менее высокой селективностью действия на биологические объекты, чем НИЛИ с переменной генерацией импульса (Москвин С.В., 2000). Условия выделения и дизайн проведения эксперимента были аналогичны модели, использованной нами при исследовании влияния излучения с переменной генерацией импульса.
Таблица 1.
Сравнительный анализ дозозависимого влияния НИЛИ с переменной генерацией импульса с частотой 100Гц, при длине волны 0,63 мкм, экспозиции 12,5 мин. на функциональную активность нейтрофилов периферической крови доноров (М±m)
| Показатели | Дозы облучения в Дж/см2 | ||||||
| 0,018 | 0,036 | 0,072 | 0,14 | 0,28 | 0,56 | 1,1 | |
| Показатель люминесценции лизосом,у.е | 451.3±14.57* | 294.3±12.51*,** | 224.3±11.54*,** | 224.6±11.59*,** | 195.6±11.51*,** | 156.6±11.52*,** | 206.6±11.50*,** |
| Активность лизосом, % | 95.21±1.25* | 68.21±1.25*,** | 44.21±1.12*,** | 60.2±1.16*,** | 49.2±1.12*,** | 38.2±1.13*,** | 78.2±1.12*,** |
| НСТ- спонтанная, % | 43.88±1.59* | 53.55±1.44*,** | 61.1±1.41*,** | 67.1±1.24*,** | 72.1±1.34*,** | 96.1±1.42*,** | 30.1±1.41*,** |
| НСТ- спонтанная, у.е | 0.48±0.05* | 0.65±0.05*,** | 0.78±0.02*,** | 0.82±0.01*,** | 0.88±0.01*,** | 0.98±0.01*,** | 0.50±0.01*,** |
| НСТ-индуцированная,% | 67.86±1.45* | 73.86±1.42*,** | 74.86±1.32*,** | 83.86±1.34*,** | 93.86±1.31*,** | 99.86±1.22*,** | 43.86±1.23*,** |
| НСТ-индуцированная, у.е | 0.79±0.03* | 0.82±0.03*,** | 0.75±0.02*,** | 0.81±0.01*,** | 0.88±0.01*,** | 0.96±0.01*,** | 0.52±0.01*,** |
| Функциональный резерв нейтрофилов | 2.49±0.13* | 1.30±0.13*,** | 1.18±0.11*,** | 1.15±0.11*,** | 1.25±0.11*,** | 1.1±0.12*,** | 1.43±0.12*,** |
| Активность фагоцитоза,% | 64.19±1.54* | 75.19±1.53*,** | 85.19±1.32*,** | 89.19±1.21*,** | 94.19±1.30*,** | 98.19±1.31*,** | 44.19±1.31*,** |
| Интенсивность фагоцитоза | 2.16±0.11* | 3.13±0.12*,** | 3.62±0.11*,** | 3.66±0.15*,** | 3.81±0.10*,** | 4.01±0.13*,** | 1.62±0.14*,** |
Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей разных групп, использован критерий Мана-Уитни
Таблица 2
Сравнительный анализ дозозависимого влияния НИЛИ с постоянной генерацией импульса при длине волны 0,63 мкм, экспозиции 12,5 мин. на функциональную активность нейтрофилов периферической крови доноров(М±m)
| Показатели | Дозы облучения в Дж/см2 | ||||||
| 0,018 | 0,036 | 0,072 | 0,14 | 0,28 | 0,56 | 1,1 | |
| Показатель люминесценции лизосом,у.е | 300.19±12.12* | 259.19±10.14*,** | 249.19±12.22*,** | 230.19±10.21*,** | 229.19±11.16*,** | 201.19±11.04*,** | 181.19±13.02*,** |
| Активность лизосом, % | 90.08±1.02* | 79.08±1.03*,** | 72.08±1.01*,** | 69.08±1.03*,** | 63.05±1.03*,** | 56.08±1.04*,** | 48.05±1.03*,** |
| НСТ- спонтанная, % | 35.59±1.25* | 42.59±1.22*,** | 44.59±1.20*,** | 54.59±1.22*,** | 64.59±1.23*,** | 88.59±1.19*,** | 98.59±1.20*,** |
| НСТ- спонтанная, у.е | 0.39±0.01* | 0.47±0.03*,** | 0.58±0.03*,** | 0.62±0.04*,** | 0.69±0.03*,** | 0.76±0.04*,** | 0.89±0.01*,** |
| НСТ-индуцированная,% | 58.13±1.41* | 69.13±1.44*,** | 79.13±1.41*,** | 82.13±1.42*,** | 89.13±1.43*,** | 95.13±1.44*,** | 99.13±1.41*,** |
| НСТ-индуцированная, у.е | 0.67±0.03* | 0.79±0.01*,** | 0.88±0.02*,** | 0.91±0.02*,** | 0.94±0.03*,** | 0.96±0.01*,** | 0.98±0.03*,** |
| Функциональный резерв нейтрофилов | 2.27±0.11* | 1.65±0.10*,** | 1.79±0.11*,** | 1.79±0.13*,** | 1.41±0.12*,** | 1.10±0.14*,** | 1.02±0.11*,** |
| Активность фагоцитоза,% | 54.85±1.21* | 66.85±1.20*,** | 72.85±1.21*,** | 80.85±1.23*,** | 86.85±1.20*,** | 95.85±1.24*,** | 98.85±1.22*,** |
| Интенсивность фагоцитоза | 1.78±0.09* | 2.1±0.09*,** | 2.31±0.09*,** | 2.51±0.09*,** | 2.55±0.09*,** | 2.65±0.09*,** | 2.75±0.09*,** |
Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей разных групп, использован критерий Мана-Уитни
Исследование invitroразличных параметров ЛО с постоянной генерацией импульса позволил выявить оптимальную дозу, при которой зарегистрировано максимальное усиление функциональной активность НГ. Такими параметрами являются доза излучения 1,1 Дж/см2, время экспозиции 12,5мин (20-кратное увеличение времени экспозиции от первоначального) (таблица2).
Анализ полученных результатов показал, что при импульсном режиме излучения доза, необходимая для максимальной активации клетки (0,056Дж\см2) ниже значений, позволяющей достичь аналогичного эффекта при ЛО с постоянной генерацией импульса (1,1Дж\см2). Тем не менее, изменения функциональной активности клеток имели одинаковую динамику, направленную в сторону усиления активности нейтрофила, независимо от режима следования импульса. Результаты наших исследований коррелируют с мнением И.И. Горяйнова (Горяйнов И.И.,1998), о том, что действие кванта света на разных режимах излучения имеет сходное биостимулирующее действие на клетку, т. е истинная природа фотоакцепторов квантов света оказывается не имеющей решающего значения, ибо их количество и многообразие вполне может уравнивать (усреднять) вторичные эффекты лазерных воздействий.
Наиболее значительные изменения зарегистрированы нами при анализе влияния НИЛИ с переменной и постоянной генерацией импульса на процессы внутриклеточной бактерицидности НГ. Можно предположить, что это данный процесс связан со стимуляцией лазерным излучением активности, локализованных в гранулах цитоплазмы НГ ферментов гексозомонофосфатного шунта, в частности НАДФ•H-оксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, отвечающей за редукцию НСТ (Маянский А.Н., 2006).
Для изучения правильности нашего предположения проведено измерение активности фермента НАДФ•Н-оксидазы, которой принадлежит ключевая роль в развитии респираторного взрыва, поскольку данный фермент осуществляет транспорт электронов от НАДФ цитозоля к молекулярному кислороду, а НИЛИ может являться физическим стимулятором выработки данного фермента (таблица 3).
Результаты исследований подтверждают наше предположение о том, что НИЛИ стимулирует выработку локализованных в гранулах цитоплазмы нейтрофилов фермента - НАДФ•Н оксидазы, поскольку нами зарегистрировано достоверное усиление выработки данного фермента более выраженное при облучении взвеси НГ с лазером с переменной генерацией импульса при дозе излучения 0,56 Дж/см2
Таблица 3
Влияние лазерного излучения с постоянной и переменной генерацией импульса на выработку НАДФН-оксидазы нейтрофилами, выделенными из крови доноров (М±m)