1.4 Патентний пошук
1.4.1 Штам цвілевого гриба Aspergillus аwamori IMBF-100017 - продуценту амілолітичних ферментів
Суть винаходу: Винахідвідноситься дохарчової промисловості, зокрема до спиртової, і може бути використаний на спиртових заводах для оцукрювання крохмалемісних субстратів. Відоміпродуценти амілолітичних ферментів Asp. niger, Asp. oryzae, Rhizopus, Asp. awamon штам 224-21, 78-2, AK-1 (Глюкоамипаза микроорганизмов - M1975 -C 6-10) Відомий штам Asp. awamon № 466, якийзастосовується на спиртових заводах дляодержання ферментів глкжоамілазного комплексу (Промисловий регламент виробництва аміпоглюкавамаріну Гх-466, Київ, 1995 - С 3 -4), але цей штам має не дуже високу активність синтезу амілолітичних ферментів За 120 -144 год росту накопичує 140-180 од/см3 активності
Задача винаходу – селекція нового штаму Asp. awamon з підвищеною бюсинтетичною активністю і швидкістю росту культури. Технічний результат, який одержують від реалізації винаходу полягає в підвищенні ферментативної активності штаму та швидкості його росту.
Описання винаходу: Досягається технічнийрезультат використанням нового штаму AspergillusawamonIMBF 100017 – продуцента амілолітичних ферментів для оцукрювання крохмалю з підвищеною бюсинтетичною активністю. При цьому виникає пов'язана з технічним результатом споживча властивість заявляемого об'єкту – підвищення виходу і активності цільового продукту. Штам пліснявого гриба AspergillusawamonIMBF 100017 відселекційоновано шляхом багатоступінчатого відбору з виробничої популяції продуценту амілолітичних ферментів Одержаний штам гриба AspergillusawamonIMBF 100017 має такі морфологічні та фізіологічні ознаки.
Культурально-морфолопчні ознаки.На середовищі Чапека із сахарозою гігантська колонія на 12 добу росту при температурі 30°С має розмір 39,0 - 43,0мм, форма колоній кругла, колір колонії від темно-коричневого до чорного, край колонії нерівний, поверхня колонії плоска, складчастість слабо виражена, переважно в центрі колони, пігмент із зворотної сторони колони світлокоричневий, ексудат відсутній, конідії утворюються по всій поверхні колонії, більш щільно в центрі колонії, колір конідій від темно-коричневого до чорного. Через 12 діб проводять мікроскопічне дослідження колоній гриба на чашках Петрі з метою вивчення органів розмноження. При спостереженнікраюколонії виявлено сегментований міцелій, від якого вертикально відходять конідієносці На їх вершинах утворюються розширення у вигляді головок, або булав, на поверхні яких з'являються чисельні дрібні вирости-стеригми Стеригми прості, не розгалужуються Від стеригм відшнуровуються ланцюжки округлих гладеньких темнокоричневих або чорних конідій. Розмноження безстатеве, вегетативне, шляхом утворення конідій. Фізіологічні ознаки. На рідких поживних середовищах культура здатна утилізувати крохмаль, сахарозу, глюкозу, мальтозу.
Оптимальна температура росту на рідких поживних середовищах - 30°С.
Тип дихання – аеробний.
Технологічнахарактеристика: При вирощуванні гриба штаму 1MB F 100017 на водно-борошняній суспензії (концентрація сухих речовин кукурудзяного, житнього або пшеничного сусла повинна бути не менше 18 - 20%) культура активно синтезує ферменти глюкоамілазного комплексу При глибинному культивуванні на 5 добу в умовах інтенсивної аерації глюкоамілазна активність досягає 200 - 220 од/см3). Біотехнологічні показники заявленого штаму 1MB F 100017 ілюструються прикладом.
Приклад: Оцінку виробничих якостей штаму 1MB F 100017 проводили методом глибинного культивування на розвареній оцукреній водно-борошняній суспензії Співвідношення борошна і води 1 2,5, оцукрювали бактеріальною а-амілазою (1,5 од/г крохмалю) Витрати повітря на аерацію 25 - ЗО м3/м3/год при постійному перемішуванні 110-120 об/хв.
Температура культивування - 35°С
Тривалість процесу -120 годин
В культуральній рідині (в кінці вирощування) визначали активність амілолітичних ферментів. Дані, які підтверджують перевагу заявленого штаму в порівнянні зі штамом-прототипом, наведені є таблиці 1.1.
Таблиця 1.1. Показники продуктивності шатму гриба Asp.awamon
| Показники | Штами гриба Asp.awamon | |
| (заявлений) | (прототип) | |
| Тривалість процесу, год | 120 | 144 |
| а-аміпазна активність, од/см3 | 50 ±5 | 30 ±5 |
| Глюкоамілазна активність од/см3 | 150±10 | 110 ± 10 |
| Сумарна амілолггична активність, од/см3 | 200 - 220 | 140-180 |
Як видно з таблиці, при використанні заявленого штаму а-амілази накопичусться на 15% більше ніж за прототипом Глюкоамілазна активність - на 36% більше, ніж за прототипом Тривалість процесу накопичення ферментів скорочується на 20%
Таким чином застосування заявленого штаму дозволяє збільшити на 20 - 30% накопичення амілолггичних ферментів, а також скоротити тривалість їх накопичення на 20%
Номер патенту: 47822
Клас (и) патенту: C12N 1 / 14, C12R 1 / 665, C12P 7 / 06
Номер заявки: 2001096648
Дата подачі заявки: 28.09.2001
Дата публікації: 15.07.2002
Заявник (и): Український науково-дослідний інститут спирту і біотехнології продовольчих продуктів.
Автор (и): Олійнічук Сергій Тимофійович; Левандовський Леонід Вікторович; Ткаченко Алла Феодосіївна; Рудніченко Людмила Вікторівна; Коваль Катерина Олександрівна; Бейко Наталія Євгенівна
Патентовласник (и): Український науково-дослідний інститут спирту і біотехнології продовольчих продуктів.
1.4.2 Штам бактерій Васillus licheniformis – продуцент комплексу термостабільним амілолітичні і протеолітичних ферментів
Суть винаходу: винахід відноситься до біотехнології і може бути використане в спиртовому, крохмале-патоковому, пивоварному, хлібопекарському, кондитерському, плодово-ягідному, текстильному виробництвах, де потрібні ферменти, стійкі до підвищених температур. Штам бактерій Bacillus licheniformis ВКМ У-2184 Д виділений селекційним шляхом при вивченні природної мінливості штаму МКПМ В-6508 із застосуванням методів ефективного мутагенезу. Продукує комплекс, що містить не менше п'яти термостабільних амілолітичних і протеолітичних ферментів. Активний діапазон значень рН 5,0-11,0 і температури 30-105 º С з максимальною активністю альфа-амілази при 90-95 º С, пуллуланази - при 75 º С, протеази - при 60 º С. Перспективний для одночасної обробки крохмалю або крохмалевмісних сировини з метою його глибокого гідролізу і як продуцент лужних протеаз для глибокого розщеплення білків до амінокислот. Штам має підвищену здатність синтезу комплексу термостабільним амілолітичні і протеолітичних ферментів, що володіє також бета-глюканазной і ламінаріназной активностями.
Номер патенту: 2177995
Клас (и) патенту: C12N1/20, C12N9/28, C12N9/44, C12N9/56, C12N1/20, C12R1: 10
Номер заявки: 98102082/13
Дата подачі заявки: 05.02.1998
Дата публікації: 10.01.2002
Заявник (и): Товариство з обмеженою відповідальністю Науково-виробнича компанія "Фермтек"
Автор (и): Цурікова Н.В.; Нефедова Л.І.; Окунєв О.Н.; Синицин А.П.; Черноглазов В.М.
Патентовласник (и): Товариство з обмеженою відповідальністю Науково-виробнича компанія "Фермтек"
Опис винаходу: винахід відноситься до галузі біотехнології, а саме до отримання комплексу амілолітичних і протеолітичних ферментів, і може бути використане в мікробіологічнійпромисловості. Амілолітичні ферменти широко використовуються для розрідження або перетворення крохмалю і крохмалевмісної рослинної сировини в такі продукти, як мальтодекстрин, цукрові сиропи, декстрозу, мальтозу, глюкозу та ін При промисловому використанні амілолітичних ферментів необхідні термостабільні ферменти, що обумовлені їх здатністю вести гідроліз сировини при високих температурах - 80-100 º С, що дуже важливо з точки зору ведення процесу клейстерізації крохмалю. При цьому поєднуються два процеси: клейстерізація крохмалю і його ферментативний гідроліз. Значно знижується вартість ферментативного процесу за рахунок скорочення дозування ферменту і тривалості гідролізу крохмалю, більш якісно ведеться підготовка сировини до розварювання - забезпечується висока ступінь гідролізу крохмалю і, як наслідок цього, збільшується вихід цільового продукту. Для переважної більшості продуцентів амілолітичних ферментів характерний переважний біосинтез одного з ферментів. Здатність до утворення комплексу ендогенних амілолітичних ферментів, особливо термостабільності, виявляється дуже рідко. У цьому зв'язку можна назвати ряд термостабільним анаеробів з роду Clostridium. Відомий штам Clostridium thermohidrosulfuricum, що синтезує комплекс, що містить термостабільні пуллуланазу і глюкоамілазу. У літературі описано декілька анаеробних термофілів з роду Clostridium, що здійснюють біосинтез амілази і пуллуланази або альфа-амілази і глюкоамілази, активних при високій температурі. Однак складність культивування анаеробних бактерій в заводських умовах робить цей спосіб отримання препарату амілолітичних ферментів практично непридатним. З літературних даних відомо, що найбільш термостабільними гідролітичними ферментами, такими як альфа-амілази, пуллуланази, а в ряді випадків і протеази є ферменти, які продукують термофільних бактерій Bacillus licheniformis. Відомий аеробний Термофіл Bacillus licheniformis, який при культивуванні на середовищі з кукурудзяної борошном оптимального для отримання продукту складу синтезує комплекс позаклітинних амілолітичні ферментів - альфа-амілазу і пуллуланазу в кількості 2 од / мл і 0,68 од / л відповідно (5). Недоліком цього штаму є низька активність продукуються ферментів, вузький спектр дії комплексу і тривалість процесу культивування (144 години). Недоліками штаму є порівняно низький рівень активності, а також висока вартість культивування через застосування висококонцентрованою живильного середовища та тривалості процесу.
Культурально-морфологічні ознаки: Клітини являють собою грампозитивні, поодинокі рухливі палички розміром 0,6-0,8 і 0,2-0,3 мк, спороутворюючі. У перші години зростання (логарифмічна фаза) утворюються ланцюжки з 2-3 клітин більш витягнутої форми, до 48-56 години зростання (стаціонарна фаза) ланцюжка розпадаються, клітини товщають, з'являються спори, що мають центральне положення і овальну форму.