Виготовлення лікарських препаратів на основі амілолітичних ферментів (стр. 3 из 14)

2. МЕХАНІЗМ ДІЇ ТА ВЛАСТИВОСТІ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ

2.1 Властивості та структура ферментів

Принципова структура ферменту наступна: кожен фермент складається з апофермента і коферменту, які, кожен окремо, не активний, але виявляють свою дію в комплексі - холоферменті. Всі ферменти мають білкову природу. Вони являють собою або прості білки, цілком побудовані з поліпептидних ланцюгів і розпадаються при гідролізі тільки на амінокислоти (наприклад, гідролітичні ферменти трипсин і пепсин, уреаза), або - в більшості випадків - складні білки, що містять разом з білкової частиною (апоферментом) небілкової компонент (кофермент або простетичної групу). Багато ферменти з великою молекулярною масою проявляють каталітичну активність тільки у присутності специфічних низькомолекулярних речовин, які називаються коферментом (або кофактором). Роль коферментів грають більшість вітамінів і багато мінеральних речовин. Вітаміни РР (нікотинова кислота, або ніацин) і рибофлавін, наприклад, входять до складу коферментів, необхідних для функціонування дегідрогеназ. Цинк - кофермент карбоангідрази, ферменту, який каталізує вивільнення з крові діоксиду вуглецю, який видаляється з організму разом з повітрям, що видихається. Залізо і мідь служать компонентами дихального ферменту цитохромоксидази. Речовини, яка піддається перетворенню в присутності ферменту, називають субстратом. Субстрат приєднується до ферменту, який прискорює розрив одних хімічних зв'язків в його молекулі та створення інших; що утворюється в результаті продукт від'єднується від ферменту. Продукт теж можна вважати субстратом, оскільки всі ферментативні реакції в тій чи іншій мірі оборотні.

За типом реакцій, що каталізуються ферменти підрозділяються на 6 класів згідно ієрархічної класифікації ферментів (КФ, EC - Enzyme Comission code). Кожен клас містить підкласи, так що фермент описується сукупністю чотирьох чисел, розділених крапками. Перше число грубо описує механізм реакції, що каталізується ферментом:

КФ 1: оксидоредуктаиз, каталізують окислення або відновлення.

КФ 2: трансферази, каталізують перенос хімічних груп з однієї молекули субстрату на іншу.

КФ 3: Гідролази, каталізують гідроліз хімічних зв'язків. Приклад: естерази, пепсин, трипсин, амілаза, ліпопротеінліпаза

КФ 4: Ліази, каталізують розрив хімічних зв'язків без гідролізу з утворенням подвійного зв'язку в одному з продуктів.

КФ 5: Ізомерази, каталізують структурні або геометричні зміни в молекулі субстрату.

КФ 6: Лігази, каталізують утворення хімічних зв'язків між субстратами за рахунок гідролізу АТФ.

Будучи каталізаторами, ферменти прискорюють як пряму, так і зворотну реакції, тому, наприклад, ліази здатні каталізувати і зворотну реакцію – приєднання по подвійним зв'язкам.

Ферменти являють собою біокаталізатори білкової природи. Каталізуючи переважна більшість біохімічних реакцій в організмі, ферменти регулюють обмін речовин і енергії, граючи тим самим важливу роль у всіх процесах життєдіяльності. Всі функціональні прояви живих організмів (дихання, м'язова скорочення, передача нервового імпульсу, розмноження і т.д.) забезпечуються дією ферментних систем. Сукупністю ферментних реакцій, що каталізуються, є синтез, розпад та інші перетворення білків, жирів, вуглеводів, нуклеїнових кислот, гормонів та інших сполук.

Активність ферментів визначається їх тривимірної структурою [3]. Як і всі білки, ферменти синтезуються у вигляді лінійного ланцюжка амінокислот, яка згортається певним чином. Кожна послідовність амінокислот згортається особливим чином, і виходить молекула (білкова глобула) має унікальні властивості. Кілька білкових ланцюгів можуть об'єднуватися в білковий комплекс. Третинна структура білків руйнується при нагріванні або дії деяких хімічних речовин.

Щоб каталізувати реакцію, фермент повинен зв'язатися з одним або декількома субстратами. Білковий ланцюг ферменту згортається таким чином, що на поверхні глобули утворюється щілина, або западина, де зв'язуються субстрати. Ця область називається сайтом зв'язування субстрату. Зазвичай він збігається з активним центром ферменту або знаходиться поблизу нього. Деякі ферменти містять також сайти зв'язування кофакторів або іонів металів.

Фермент, з'єднуючись з субстратом:

• очищає субстрат від водяної «шуби»

• має у своєму розпорядженні реагують молекули субстратів в просторі за потрібне для протікання реакції чином

• готує до реакції (наприклад, поляризує) молекули субстратів.

Зазвичай приєднання ферменту до субстрату відбувається за рахунок іонних або водневих зв'язків, рідше – за рахунок ковалентних. Наприкінці реакції її продукт (або продукти) відділяються від ферменту.

У результаті фермент знижує енергію активації реакції. Це відбувається тому, що в присутності ферменту реакція йде іншим шляхом (фактично відбувається інша реакція), наприклад:

У відсутності ферменту:

А + В = АВ

У присутності ферменту:

А + Ф = АФ

АФ + В = АВФ

АВФ = АВ + Ф

де А, В - субстрати, АВ - продукт реакції, Ф - фермент.

Ферменти не можуть самостійно забезпечувати енергією ендергонічні реакції (для протікання яких потрібна енергія). Тому ферменти, що здійснюють такі реакції, сполучати їх з екзергонічними реакціями, що йдуть з виділенням більшої кількості енергії [2,7].

2.2 Класифікація амілолітичних ферментів

Амілолітичні ферменти об'єднують велику групу ферментів, які здійснюють гідроліз переважно α-(1,4)-Глікозидних зв'язків амілози, амілопектину, глікогену та інших мальтоолігосахаридів. До групи амілолітичних ферментів відносяться наведені нижче і деякі інші ферменти:

КФ 3.2.1.1 α-амілаза

КФ 3.2.1.2 β-амілаза

КФ 3.2.1.3 Глюкоамілаза

КФ 3.2.1.41 Пуллуланаза

КФ 3.2.1.68 Ізоамілаза

КФ 3.2.1.20 α-глюкозидази

КФ 3.2.1.11 Декстраназа

КФ 2.4.1.19 Амілаза Bacillus macerans (циклодекстроглюканотрансфераза)

Амілази бувають двох типів: ендо-і екзоамілази. Чітко вираженої ендоамілазой є α-амілаза, здатна до розриву внутрішньомолекулярних зв'язків у полімерних ланцюгах субстрату. Глюкоамілаза і β-амілаза є екзоамілазами, тобто ферментами, що атакують субстрат з нередукуючого кінця.

Субстратами для дії амілаз є крохмаль, що складається з амілози і амілопектину, продукти часткового гідролізу крохмалю і глікоген. Крохмаль - рослинний полісахарид з дуже складною будовою. Цей двокомпонентний з'єднання, що складається з 13-30% амілози і 70-85% амілопектину. Обидва компоненти неоднорідні, їх молекулярна маса (М. м.) коливається в широких межах і залежить від природи крохмалю. Амілоза - це необертающийся полімер, в якому залишки глюкози Сполучених α-1,4-Глікозидний зв'язком; ступінь полімеризації близько 2000. У «аномальних» амілози з однією-двома α-1,6-зв'язками полімеризація може зрости до 6000. Амілоза практично не має відновлюючої здатності, тому що в кожній молекулі амілози є тільки один вільна альдегідна група [8].

Реакції, що каталізуються амілазами, мають дві стадії: коротку передстаціонарну і тривалу – стаціонарну. Під час першої стадії ендоамілаза швидко зменшує молекулярну масу субстрату, утворюючи суміш лінійних та розгалужених олігосахаридів. Другий етап реакції триває, поки продукти гідролізу не перестануть забарвлюватися йодом; він протікає значно повільніше і залежить від індивідуальних властивостей ферменту та його природи[9].

α-амілаза (1,4-α-D-глюканглюканогідролаза) є ендоамілазою, що викликає гідролітичні розщеплення α-1,4-глікозидних зв'язків всередині полімерного субстрату. Це водорозчинний білок, що має властивості глобуліну і має молекулярну масу 45-60 кДа. Всі α-амілази відносяться до металоензимів, вміст у них Са коливається від 1 до 30 г-атом / 1 г-моль ферменту. Повне видалення Са приводить до інактивації ферменту. Глутамінова і аспарагінова кислоти становлять 25 мас. % Від маси білка. Залежно від виду мікроорганізму властивості α-амілаз можуть сильно відрізнятися не тільки за механізмом дії на субстрат і по кінцевим продуктам, але і за оптимальними умовами для прояву максимальної активності. Присутність в промислових препаратах протеїназ знижує каталітичну активність α-амілази. У результаті впливу α-амілази на перших стадіях в гідролізаті накопичуються декстрини, потім з'являються тетра- і тримальтоза, що не зафарбовуються йодом і які дуже повільно гідролізуються α-амілазою до ди- і моносахаридів[5].

Рисунок 2.1. Механізм дії α-амілази[2]

β-амілаза (β -1,4-глюкан мальтогідролаза, КФ 3.2.1.2) - активний білок, що володіє влатсивостями альбуміну. Каталітичний центр ферменту має сульфгідрильні і карбоксильні групи і імідозольний цикл залишків гістидину. β-Амілаза –екзофермент кінцевої дії, що виявляє спорідненість до передостаннього β -1,4-зв'язку з нередукуючого кінця лінійного ділянки амілози і амілопектину.

На відміну від α-амілази β-амілаза практично не гідролізують нативний крохмаль, тоді як клейстеризований крохмаль гідролізуєтся нею з утворенням мальтози β-конфігурації. Якщо гідролізу піддається амілоза, то гідроліз йде повністю до мальтози. Незначна кількість декстринів може здіснюватися при гідролізі «аномальної» амілози, тому що гідроліз β-амілазою йде тільки по лінійній ланцюга до α -1,6-зв'язків. Якщо субстратом для β-амілази служить амілопектин, то гідроліз йде в значно меншому ступені. β-Амілаза відщеплює фрагмент з нередукуючим кінцем ділянки від зовнішніх лінійних гілок, які мають по 20-26 глюкозних залишків, з утворенням 10-12 молекул мальтози. Гідроліз призупиняється на передостанній α -1,4-зв'язку, що межує з α -1,6-зв'язком. У гідролізаті накопичується 54-58% мальтози, решту становлять високомолекулярні декстрини, що містять значну кількість α -1 ,6-зв'язків – так звані β -декстрини.