Враховуючи те, що значна частина виділених БЗІ за всіма ознаками належить до імуноглобулінів, які відіграють суттєву роль при різноманітних патофізіологічних станах, ми вважали за доцільне дослідити їх детальніше. Це спонукало нас до опрацювання власного методу ІФА для визначення ІА та ІАА в сироватках крові людей. У подальшому цей метод планувалось використати для визначення їх вмісту в усіх білкових фракціях, виділених методом поетапної афінної хроматографії з сироваток крові здорових людей та хворих на ЦД.
При відпрацюванні початкового етапу – зв’язування антигену з твердою фазою, були апробовані планшети типів “PoliSorp”, “MediSorp” та “MaxiSorp” виробництва фірм “Dynatech” і “Nunc”. Ми дійшли висновку, що для нашої мети найбільш придатні планшети типу “MediSorp” і всю подальшу роботу проводили з використанням саме цих носіїв.
Для розведення сироваток та блокування неспецифічного зв’язування сироваткових білків із вільними від інсуліну місцями на планшеті використовували розчин знежиреного молока в 0,1 М фосфатно-сольовому буферному розчині з додаванням твіну 20.
При визначенні оптимальної концентрації інсуліну, необхідної для сорбції на твердій фазі, використовували кристалічний напівсинтетичний інсулін людини виробництва фірми “Hoechst”. Показано, що застосування розчину інсуліну з концентрацією 25 мкг / мл є найбільш вдалим, оскільки в цьому випадку співвідношення ОГ всіх позитивних за вмістом ІА сироваток (0,423) до ОГ всіх негативних (0,051) – найкраще (табл. 1). Збільшення концентрації інсуліну в розчинах для сорбції (50 мкг / мл) не призводило до суттєвого поліпшення результатів. Проте, використання інсуліну в високих концентраціях може призвести до нашарування молекул гормону, які під час відмивання зсуваються й частково видаляються разом із промивним розчином (0,1 М фосфатно-сольовий буферний розчин з 0,05 % тритоном Х-100).
Незважаючи на те, що при використанні розчинів з меншим вмістом інсуліну реєструються вищі значення ОГ, існує можливість отримати хибно-позитивні результати за рахунок сорбції ІgG сироватки крові з “вільними” місцями в лунках планшетів (див. результати визначення вмісту ІА в сироватках № 482 і № 468).
Таблиця 1
Результати визначення антиінсулінових антитіл у сироватках крові здорових людей та хворих на цукровий діабет при використанні різних концентрацій напівсинтетичного інсуліну людини (“Hoechst”) у розчині для сенсибілізації планшетів “Dynatech”
| Сироватки №№ | Концентрація інсуліну (мкг/мл) | ||||||
| 0,5 | 1,0 | 5,0 | 10,0 | 25,0 | 50,0 | ||
| Здорові люди | 7 | 0,058 | 0,037 | 0,022 | 0,022 | 0,021 | 0,022 |
| 185 | 0,321 | 0,290 | 0,157 | 0,101 | 0,052 | 0,046 | |
| 482 | 0,769 | 0,774 | 0,182 | 0,099 | 0,068 | 0,061 | |
| 468 | 0,476 | 0,499 | 0,135 | 0,078 | 0,063 | 0,061 | |
| М ± m | 0,406 ± 0,15 | 0,400 ± 0,16 | 0,164 ± 0,04 | 0,075 ± 0,02 | 0,051 ± 0,01 | 0,048 ± 0,01 | |
| Хворі на ЦД | 10 | 0,203 | 0,206 | 0,266 | 0,326 | 0,449 | 0,536 |
| 14 | 0,642 | 0,595 | 0,285 | 0,286 | 0,286 | 0,288 | |
| 171 | 0,120 | 0,095 | 0,281 | 0,352 | 0,508 | 0,508 | |
| 423 | 0,320 | 0,389 | 0,469 | 0,501 | 0,455 | 0,445 | |
| М ± m | 0,321 ± 0,23 | 0,321 ± 0,22 | 0,325 ± 0,10 | 0,366 ± 0,09 | 0,423 ± 0,10 | 0,444 ± 0,11 | |
| Тло | 0,014 | 0,010 | 0,013 | 0,011 | 0,010 | 0,012 | |
Примітки: тло – проба без сироватки; жирним шрифтом позначено ОГ, що перевищує граничне значення; курсивом позначено ОГ, що знаходиться в межах граничних значень; результати представлено в одиниця ОГ.
При опрацюванні методу проводились експерименти, мета яких полягала у з’ясуванні можливості використання інсулінів різного походження та виробництва різних фірм для сенсибілізації твердої фази. Це мало суто практичний інтерес, бо дає змогу, у разі потреби, замінити інсулін людини фірми “Hoechst”, на інший – з таким же ефектом. Для цього відібрали кристалічні інсуліни людини та свині, лікарські форми інсулінів, а для порівняння – А21-монодезамідоінсулін (табл. 2).
Як видно з табл. 2, при визначенні вмісту ІА в одних і тих самих сироватках, отримано подібні результати (ОГ/ГЗ негативних зразків від 0,021 до 0,028; ОГ/ГЗ позитивних зразків від 2,61 до 3,61) при використанні всіх інсулінів, крім А21-монодезамідоінсуліну (ОГ/ГЗ негативних зразків 0,013, а позитивних – 0,99), що можна пояснити наявністю в нього специфічних антигенних детермінант.
Таблиця 2
Вміст антитіл до інсуліну у відібраних позитивних та негативних сироватках крові людей за умов сенсибілізації планшетів різними інсулінами
| Зразки | ІНСУЛІНИ (25 мкг/мл) | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| В-к | 0,09 | 0,10 | 0,09 | 0,11 | 0,06 | 0,09 | 0,09 | 0,09 | 0,09 | 0,06 |
| М-ко | 0,11 | 0,09 | 0,08 | 0,06 | 0,10 | 0,08 | 0,12 | 0,12 | 0,51 | 0,06 |
| 46 | 0,55 | 0,66 | 0,61 | 0,63 | 0,53 | 0,48 | 0,53 | 0,60 | 0,50 | 0,33 |
| 449 | 0,17 | 0,23 | 0,24 | 0,14 | 0,21 | 0,25 | 0,19 | 0,19 | 0,16 | 0,10 |
| 470 | 0,19 | 0,16 | 0,21 | 0,16 | 0,21 | 0,20 | 0,18 | 0,21 | 0,16 | 0,13 |
| 79 | 0,23 | 0,22 | 0,24 | 0,18 | 0,25 | 0,21 | 0,25 | 0,33 | 0,28 | 0,11 |
| М ± m | 0,22 ±0,07 | 0,24 ± 0,09 | 0,25 ± 0,08 | 0,21 ± 0,09 | 0,23 ± 0,07 | 0,22 ± 0,06 | 0,23 ± 0,06 | 0,26 ± 0,08 | 0,28 ± 0,07 | 0,13 ± 0,04 |
| 102 | 1,63 | 1,43 | 1,60 | 1,24 | 1,70 | 1,52 | 1,36 | 1,67 | 1,82 | 0,27 |
| 151 | 3,32 | 3,08 | 3,35 | 2,99 | 2,95 | 3,45 | 4,02 | 3,15 | 4,30 | 1,03 |
| 171 | 2,93 | 2,96 | 2,86 | 2,99 | 3,02 | 4,33 | 3,93 | 3,25 | 3,95 | 1,07 |
| 423 | 2,63 | 1,86 | 2,05 | 1,71 | 2,24 | 2,81 | 2,90 | 2,87 | 1,66 | 0,62 |
| 506 | 1,23 | 1,23 | 1,37 | 1,30 | 1,22 | 1,91 | 1,85 | 1,71 | 1,37 | 0,38 |
| 554 | 6,74 | 5,96 | 6,76 | 5,45 | 5,64 | 7,34 | 6,88 | 7,57 | 8,53 | 2,57 |
| М ± m | 3,08 ± 0,80 | 2,75 ± 0,71 | 3,00 ± 0,81 | 2,61 ± 0,65 | 2,80 ± 0,64 | 3,56 ± 0,86 | 3,49 ± 0,81 | 3,37 ± 0,89 | 3,61 ± 1,11 | 0,99 ± 0,34 |
Примітки:
1. Результати представлені як співвідношення ОГ/ГЗ, де ОГ – оптична густина проби, ГЗ – граничне значення в системі.
2. Жирним шрифтом виділено значення, які перевищують граничні.
3. Сироватки: В-к, М-ко, 46 – здорових людей; 449, 470, 79 – хворих на ЦД (негативні за вмістом антитіл до інсуліну); 102, 151, 171, 423, 506, 554 – хворих на ЦД (позитивні за вмістом антитіл до інсуліну).
4. Використані інсуліни: біосинтетичний кристалічний інсулін людини: 1 – “Lilly” (США), 2 –“Novo Nordisk” (Данія); напівсинтетичний кристалічний інсулін людини “Hoechst” (Німеччина) – 3; біосинтетичний інсулін людини “Актрапід НМ” (“Novo Nordisk”) – 4; напівсинтетичний інсулін людини “Інсуман Рапід” (“Індар”, Україна); інсулін свині кристалічний (“Hoechst”) – 6; інсулін свині “Актрапід МС” (“Novo Nordisk”) – 7, “Моноінсулін МК” (“Індар”) – 8; аналог інсуліну людини “NovoRapid” (“Novo Nordisk”) – 9; кристалічний A21-монодезамідоінсулін людини (“Novo Nordisk”) – 10.
Важлива умова успішного проведення ІФА – підбір кон’югату вторинних антитіл до Іg людини з ферментом та його концентрації, оскільки при високій концентрації кон’югату спостерігається надлишкове неспецифічне зв’язування його з носієм, а при низьких концентраціях – чутливість аналізу може знижуватись в результаті уповільненого перетворення субстрату на продукт ферментативної реакції. До такого ж висновку дійшли й інші дослідники [А.В. Масяго, 2002; Н.В. Іванська, 2003].
У процесі роботи ми випробували не тільки МКА до ІgG людини, мічені пероксидазою хрону, але й поліклональні антитіла (ПКА) до всіх класів імуноглобулінів, одержані шляхом імунізації кіз (Всеросійський інститут сільськогосподарських технологій, Москва). Розведення кон’югату з МКА становило 1: 100 000, з ПКА – 1:10 000 (табл. 3).
Таблиця 3
Вміст ІА та ІАА в сироватках крові хворих на цукровий діабет
з використанням різних кон’югатів
| Досліджувані зразки | Кон’югат | |
| МКА-Пх | ПКА-Пх | |
| Тло | 0,035 | 0,043 |
| 34 | 1,627 | 0,895 |
| 38 | 0,230 | 0,947 |
| 42 | 0,566 | 0,409 |
| 99 | 0,612 | 1,188 |
| 482 | 0,904 | 1,144 |
| 6 | 0,687 | 0,496 |
| 10 | 0,815 | 0,513 |
| 14 | 0,732 | 0,698 |
| 423 | 0,633 | 0,435 |
Примітки:
1. Тло – проба без внесення сироватки.
2. МКА-Пх – моноклональні антитіла до імуноглобулінів людини класу G, мічені пероксидазою хрону.
3. ПКА-Пх – поліклональні антитіла до імуноглобулінів людини класу G, мічені пероксидазою хрону.