Як видно з представлених даних, реакція деяких сироваток (34, 42, 6, 10, 423) в ІФА була інтенсивніша з МКА, ніж з ПКА; з іншими сироватками (38, 99, 482) отримано протилежні результати. Пояснення цьому може полягати як в гетерогенності ІА та ІАА в цих зразках щодо їхньої спорідненості, так і в належності їх до різних підкласів IgG. ПКА, навіть проти однієї – єдиної антигенної детермінанти, гетерогенні як за структурою активного центра, так і за фізико-хімічними властивостями. У тому випадку, коли антиген полівалентний, як наприклад інсулін, в сироватці крові утворюються антитіла, які направлені проти кожної окремої детермінанти (епітопа); це призводить до ще більшого урізноманітнення антитіл. Усі ці фактори впливають на гетерогенність антитіл та обумовлюють певні труднощі при дослідженні їх структури та визначенні вмісту в крові [А.М. Егоров, 1991].
На початкових етапах розробки імуноферментного методу як хромоген використовували ОФД, який потребує дотримання особливих умов безпеки, пов’язаних з канцерогенними властивостями цієї речовини. Хоча ОФД і досі включають у деякі комерційні імуноферментні набори, та все ж останнім часом більш безпечним хромогеном вважають ТМБ, оскільки він сам та його метаболіти не проявляють мутагенної та канцерогенної дії [Н.В. Іванська, 2003]. З даних порівняльного аналізу хромогенів ОФД та ТМБ випливає, що при використанні обох хромогенів різниці в отриманих результатах практично немає, тому в подальшому застосовували ТМБ.
Розроблений імуноферментний метод використано для обстеження дорослих хворих на ЦД та донорів (табл. 4). Отримані результати значною мірою збігаються з даними, які наводяться в літературних джерелах [Ueno H. et al., 1994; Schloot N.C. et al., 1997; Zigler A.G. et al., 1999;].
Таблиця 4
Результати виявлення антитіл до інсуліну в сироватках крові дорослих людей опрацьованим імуноферментним методом
| Групи людей | Кіль-кістьосіб | Співвід-ношення чоловіки / жінки | Середній вік (від і до), роки | Середня тривалість захворю-вання (від і до), роки | Середня тривалість інсулінотерапії (від і до), роки | % осіб, у сироватках крові яких виявлено ІА або ІАА |
| Донори | 194 | - | 18 - 52 | - | - | 0,52 |
| Хворі на ЦД-1 | 438 | 152/286 | 36,47±0,61(17-68) | 13,61±0,49(0,5-42) | 13,61±0,49(0,5-42) | 10,96* |
| Хворі на ЦД-2 (+Iнс.) | 188 | 83/105 | 59,36±0,64(37-83) | 14,20±0,62(0,5-43) | 5,40 ± 1,17 (0,5-27) | 4,26* |
| Хворі на ЦД-2 (-Iнс.) | 104 | 41/63 | 60,01±0,82(38-81) | 9,13±0,73(0,5-36) | - | 1,92 |
Примітки: 1) +Iнс. – хворі на ЦД-2, які отримували препарати інсуліну; 2) -Iнс. – хворі на ЦД-2, які не отримували препарати інсуліну; * – достовірно стосовно групи донорів (за критерієм ч 2).
Опрацьований метод використали також для визначення вмісту ІА та ІАА в сироватках крові різних груп дітей. У жодної здорової дитини не було виявлено ІАА, в той час як у групі ризику захворювання на ЦД-1 ІАА були наявні в 5,71 % дітей. Серед дітей, хворих на ЦД-1, ІА та ІАА знайдено в 16,67 % осіб. Таким чином, показано, що розроблений імуноферментний метод придатний для визначення ІА та ІАА в сироватках крові дорослих і дітей.
Основні діагностичні характеристики будь-якого методу, які свідчать про його надійність – це чутливість, специфічність та відтворюваність отримуваних результатів.
Встановлено, що специфічність розробленого імуноферментного методу становить 90,9 %, а чутливість – 82,4 %; внутрішньосерійний коефіцієнт варіації складає 9,09 % для негативних зразків і 3,53 % для позитивних, а міжсерійний – 4,34 % для негативних зразків і 5,5 % для позитивних.
На основі розробленого твердофазного імуноферментного методу для визначення вмісту антитіл до ендогенного або екзогенного інсулінів у співавторстві з працівниками НВК “Діапроф-Мед” було створено тест-систему, яку назвали “ІФА-АТ-інс”.
Розроблену систему “ІФА-АТ-інс” порівнювали з комерційною імуноферментною тест-системою “ORG-520” (“ORGentech”, Німеччина). Деяка різниця в результатах визначення ІА обома методами може бути зумовлена різними способами оцінки граничної зони та особливостями застосованих кон’югатів.
Підсумовуючи отримані результати, можна зробити висновок, що тест-система “ІФА-АТ-інс” подібна до імуноферментної комерційної “Anti-insulin ORG-520”, відповідає вимогам, поставленим до тест-систем на основі ІФА для визначення ІА та ІАА і може бути використана для виявлення їх у сироватках крові людей.
Тест-систему “ІФА-АТ-інс” порівнювали також з комерційним радіоімунним набором “IA-AIA CIS biointernational” (Франція). При цьому проведено дві серії досліджень. Для першої серії експериментів відібрали сироватки крові 10 донорів та 79 хворих на ЦД, серед яких 48 хворих на ЦД-1 і 31 – на ЦД-2. Для другої серії відібрали сироватки від 92 хворих на ЦД-1 та ЦД-2.
У першій серії експериментів при дослідженні 48 сироваток крові від хворих на ЦД-1 методом ІФА зафіксовано 14 позитивних сироваток, 32 негативні і два сумнівних зразки. Аналіз тих же сироваток методом РІА виявив 11 позитивних та 20 негативних зразків, у 15 сироватках зв’язування міченого інсуліну з ІА становило або було менше за 20 %, тобто ІА містились в низьких титрах. З 31 сироватки крові від хворих на ЦД-2методом ІФА визначено 2 позитивних і 29 негативних зразків,а методом РІА – 2 і 27 сироваток, відповідно. Останнім методом виявлено також 2 сироватки з низькими титрами ІА. При дослідженні донорських сироваток розбіжностей між отриманими результатами не виявлено.
Постановка другої серії експериментів принципово не відрізнялась від першої. Після визначення ІА у сироватках крові хворих на ЦД невідповідні результати отримано в 5 зразках.
Таким чином, після дослідження сироваток крові хворих на ЦД тест-системою “ІФА-АТ-інс” та “IA-AIA CIS biointernational” виявилось, що у деяких випадках отримані результати не співпадають. Подібні розбіжності спостерігали й інші дослідники [L.Nell et al., 1989; K.F. Federlin, 1993; D. Devendra et al., 2003, 2004]. Пояснення цього може полягати в тому, що визначення антитіл проведено методами, які суттєво відрізняються один від одного. При застосуванні РІА, в якому використовують поліетиленгліколь, крім ІА та ІАА можуть осаджуватись й інші БЗІ, і тим самим призводити до завищення вмісту визначених ІА та ІАА. Цим можна пояснити і значну кількість сироваток з невеликим (7-20) відсотком зв’язування з 125І-інсуліном, які, згідно з інструкцією, слід відносити до позитивних.
Існують певні труднощі в інтерпретації результатів визначення ІА та ІАА у людей з ЦД. Вони полягають у тому, що в цієї категорії хворих, в залежності від віку, тривалості інсулінотерапії, типу ЦД, а також особливостей імунного статусу організму, утворюються ПКА з високою або низькою афінністю проти різних епітопів інсуліну. Слід також брати до уваги, що ендогенний або екзогенний інсулін, який міститься в сироватці хворих, здатен зв’язуватись з ІА та ІАА, утворюючи комплекси інсулін-антитіло, і тим самим змінювати кількість ІА або ІАА при визначені різними методами.
Оскільки при порівнянні тест-системи “ІФА-АТ-інс” з комерційною радіоімунною “Cis biointernational” результати визначення ІА та ІАА у частині зразків крові хворих на ЦД не співпадали, то для з’ясування можливих причин розбіжності та для більш детального дослідження БЗІ застосовували поетапну афінну хроматографію таких сироваток на сорбентах з інсуліном та білком G.
Методом поетапної афінної хроматографії з сироваток крові різних хворих на ЦД і здорових людей було виділено білкові фракції, що мають властивість зв’язуватись з інсуліном. Для цього були проаналізовані зразки сироваток крові хворих на ЦД, де кількість ІА та ІАА, визначених методами ІФА та РІА, суттєво відрізнялась (табл. 5).
Кількість білка, виділеного методом поетапної афінної хроматографії
з 1 мл сироватки крові хворих на ЦД та донорів
| Сироватки крові хворих на ЦД-1 | Кількість білка (мг), виділеного з інсулінового сорбенту | Кількість білка (мг), виділеного на сорбентах з білками А або G |
| 1) Ф-в | 0,686 | 0,086 |
| 2) Т-ч | 1,210 | 0,203 |
| 3) М-я | 0,079 | Н/д |
| 4) Б-в | 0,017 | Н/д |
| 5) Т-в | 0,028 | Н/д |
Примітка: Н/д – не досліджувалось
Загальна особливість перших трьох таких сироваток (Ф-в, Т-ч, М-я) така, що при дослідженні вмісту ІА та ІАА методом ІФА вони визначені як негативні, а при використанні РІА – як позитивні. З певною пересторогою можна вважати за контрольні дві інші сироватки хворих на ЦД-1 (Б-в, Т-в), в яких не знайшли ІА та ІАА обома застосованими методами.
З одержаних даних витікає, що в досліджених зразках крові міститься різна кількість БЗІ, проте не всі вони належать до білків імуноглобулінової природи.
Однак ці результати свідчили тільки про різницю в кількості білків, виділених на обох типах сорбентів з сироваток крові хворих на ЦД та донорів; фракції, вимиті з названих сорбентів, не були досліджені на вміст ІА. Ми вважали за доцільне провести аналогічні дослідження окремих сироваток, в яких при проведенні РІА і ІФА була розбіжність щодо вмісту ІА. Використання поетапної афінної хроматографії для таких зразків з подальшим аналізом отриманих фракцій методом ІФА дало можливість обґрунтованіше стверджувати про наявність або відсутність ІА та ІАА у нативних сироватках. Результати проведених досліджень наведено в табл. 6.
Таблиця 6
Вміст ІА у фракціях, одержаних після поетапного розподілу методом афінної хроматографії сироваток крові хворих на ЦД-1 на сорбентах інсулін-сефароза та білок G-сефароза
| Сироват-ки крові хворих на ЦД-1 | % зв’язування 125І-Iнс. з БЗІ (метод РІА) | Оцінка позитив-ності | Сорбенти | ОГ фракцій (l=280 нм) | Vфракцій (мкл), в ІФА | ОГ фракцій в ІФА | |
| РІА | ІФА | ||||||
| 1. П-ко | 35,7 - 49,0 | + | + | Інсулін-агарозаБілок G-сефароза | 0,3700,085 | 50 50 | 2,8191,214 |
| 2. С-н | 8,4 – 16,1 | + | + | Інсулін-агароза | 0,085 | 25 | 1,590 |
| 3. Ф-в | 18,0 – 40,3 | + | ± | Інсулін-агарозаБілок G-сефароза | 0,270Н/д | 5050 | 0,0760,072 |
| 4. М-я | 79,7 – 80,7 | + | - | Інсулін-агароза | 0,390 | 25 | 0,034 |
| 5. Т-ч | 12,4 – 24,1 | + | - | Інсулін-агарозаБілок G-сефароза | 0,9700,360 | 5040 | 0,0220,086 |
| 6. Гр.-й | 1,6 – 5,3 | - | - | Інсулін-агарозаБілок G-сефароза | 0,3800,290 | 1550 | 0,0180,029 |
| 7. Б-в | 1,8 – 6,8 | - | - | Інсулін-агароза | 0,135 | 50 | 0,020 |
Примітка: Iнс. – інсулін, + – позитивний зразок; ± – сумнівний зразок; - – негативний зразок за вмістом ІА, визначених даними методами.