Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені на конференції для молодих учених Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України „Перспективні напрями досліджень сучасної фізіології” (Київ, 2003); школі-семінарі для молодих учених ”Наукові космічні дослідження”, (Жукін, 2003); науково-практичній конференції “Вторинний остеопороз: епідеміологія, клініка, діагностика, профілактика та лікування”, (Київ-Тернопіль, 2003); IV Міжнародному симпозіумі “Актуальні проблеми біофізичної медицини” (Київ, 2004); школі-семінарі для молодих учених ”Наукові космічні дослідження”, (Жукін, 2004); IV Національному конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ, 2005); школі-семінарі для молодих учених ”Наукові космічні дослідження”, (Жукін, 2005); V науково-практичної конференції „Морфогенез і патологія кісткової системи в умовах промислового регіону”, (Луганськ, 2005); XVII з'їзді фізіологів України (Чернівці, 2006); VIII World Congress of International society for Adaptive Medicine (Moscow, 2006); V Міжнародному симпозіумі “Актуальні проблеми біофізичної медицини”, (Київ, 2007). Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей у наукових журналах, з них 5 – у фахових виданнях, 12 тез доповідей на наукових конференціях, з'їздах, симпозіумах, отримано 1 деклараційний патент України на винахід.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 186 сторінках (обсяг основного тексту -157 стор.) і складається зі вступу, чотирьох розділів, висновків, списку використаних літературних джерел (233 найменування), робота проілюстрована 53 рисунками та 20 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ МАТЕРІАЛИ та МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження виконані на 233 щурах-самцях лінії Вістар віком від 1 до 24 міс. Усі тварини отримані з віварію Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, де вони знаходилися на стандартному раціоні харчування. Доступ тварин до їжі та води не обмежувався. Щурів виводили з експерименту за допомогою декапітації після знерухомлення в умовах ефірного наркозу. Всі маніпуляції з тваринами здійснювали відповідно до вимог біоетики та міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей.
Дозовану гіпокінезію створювали обмеженням рухливості тварин у герметичному контейнері, що складається з блоку комірок. Жорсткому режиму обмеження рухливості відповідало відношення площі проекції тіла тварини до площі обмежувальної комірки - 1:1 (Літовка І.Г.,2006). Конструкція контейнера забезпечувала можливість заміни в ньому атмосферного повітря на нормобаричну гіпоксичну газову суміш (НГГС) із заданим парціальним тиском кисню.
Гіпоксичну газову суміш одержували за допомогою мембранного газорозподільного елемента. Об'ємну швидкість подання повітря та НГГС контролювали ротаметром "РМ-063", вміст кисню - газоаналізатором "МИК-М". Періодичність подання газової суміші й атмосферного повітря в контейнер для щурів забезпечувалася в автоматичному режимі за допомогою програмного блоку керування роботою компресорів. НГГС із парціальним тиском кисню 90-98 мм рт. ст., що еквівалентно об'ємній частці кисню рівній 12-13% кисню, подавали дослідним тваринам щодня протягом 8 год у режимі 20 хв - гіпоксична газова суміш, 20 хв - атмосферне повітря.
Дослідження ПН свіжовиділених стегнових кісток щурів проводили на установці, до складу якої входили: електронний блок з підсилювачем електричних сигналів, таймер, пристрій для фіксації та зволоження кістки, Ag-AgCl електроди із сольовим містком (0,9%-й розчин NaCl у 2%-му агарі, Cochran G.V. et al., 1989) і регістратор. Електроди розташовували в центрі діафіза стегнової кістки. При цьому електрод, який був розташований на ввігнутому боці кістки, підключали до інвертуючого, а електрод протилежного боку - до неінвертуючого входу підсилювача. Реєстрацію ПН проводили з точністю ±10 мкВ і базової похибки 0,05%. Для підтримки кістки у вологому стані використовували систему зволоження 0,9%-м розчином NaCl, рН 7,4. Дослідження проводили при 20-22°С.Механічне навантаження на кістку здійснювали в аксіальному напрямку. Його значення розраховували виходячи з умов фізіологічного розподілу вагового навантаження між передніми та задніми кінцівками щура, згідно з яким 40% вагового навантаження припадає на передні кінцівки, а 60% - на задні (FukudaS. et al., 2004). Дослідження проводили при 3 ступенях навантажень: І ступінь - 30%, ІІ ступінь - 50% і ІІІ ступінь - 100% від маси тіла тварини. Реєстрацію ПН проводили на двокоординатному самописці XY Recorder (Прага). Вимірювали амплітуду ПН (мкВ) та розраховували його величину, яка припадає на одиницю навантаження (мкВ/г).
Пасивні електричні властивості препаратів стегнових кісток щурів досліджували методом мультичастотної біоімпедансометрії на установці, до складу якої входили: прецизійний мультиметр Quad Tech 1920 (США), термостат, вимірювальна камера з електродами та комп'ютерно-програмний комплекс. Реєстрацію показників електричного імпедансу, ємності, активного та реактивного опору здійснювали в режимі реального часу з точністю до ±0,1% при швидкості вимірів один показник у секунду. Вимір проводили при роботі приладу з паралельною еквівалентною схемою, що складається з ємності й активного опору, на частотах 100 Гц, 1кГц, 10кГц, 100кГц і 1МГц при максимальної напрузі 100 мВ і точності вимірів до ±0,1%.Підготовку препаратів і вимір електричних показників проводили за методикою Kosterich J. et al., (1984) з використанням платинових електродів у напрямку перпендикулярному до поздовжньої осі препарату, в умовах його повної імерсії у 0,9%-му розчині NaCl при 370С. З метою стандартизації результатів досліджень поряд з абсолютними значеннями використовували відносні значення показників ПЕВ, які визначали з урахуванням довжини та площі перетину препарату.
Схема остеометричних досліджень складалася з визначення таких показників: маса та довжина стегнової кістки й препарату, максимальний, мінімальний і середній діаметр діафіза та кістковомозкового каналу, середня товщина стінки діафіза. Розраховували також індекси відношення діаметра кістковомозкового каналу до діаметра діафіза й відношення товщини стінки діафіза до його діаметра й діаметра кістковомозкового каналу (Алексєєв В.П.,1966). Всі остеометричні показники визначали за допомогою мікрометра з оптичною системою, який забезпечує точність вимірів ± 0,01мм і припустиму похибку ±0,004 мм.
Демінералізацію препаратів проводили за допомогою повного занурення в 10%-й розчин динатрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА), рН 8,0. Розчин міняли щодня. Контрольні дослідження ПЕВ проводили на 14 і 28 добу демінералізації. Препарат витягали з розчину ЕДТА, ретельно промивали у 0,9%-му розчині NaCl та залишали на 24 год у свіжоприготовленому розчині. Через добу препарат ще раз промивали 0,9%-м розчином NaCl та визначали показники ПЕВ відповідно до описаної вище методики. Повноту демінералізації контролювали спалюванням препарату в муфельній печі наприкінці експерименту.
Дозовану термічну денатурацію препаратів проводили за допомогою його повного занурення на 30 с у 0,9%-й розчин NaCl , нагрітого до 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 або 1000С ±0,50С. Всі виміри проводили через 25 с після забирання препарату з нагрітого розчину при 370 С.
Напруження кисню в литковому м'язі щурів вимірювали in situ полярографічним методом з використанням відкритого платинового електрода на полярографі LP7 (Прага) (Березовський В.А.,1975). Споживання кисню в окремих фрагментах стегнової кістки визначали за допомогою платинового електрода за методикою Shirrmacher K. et al.,(1997). Спонгіозну частину кісткових фрагментів відмивали у 0,9%-му розчині NaCl при 25-280С і рН 7,4. Маса кісткових фрагментів становила від 70 до 100 мг, товщина - 130-500 мкм. Фрагменти стегнової кістки поміщали в циліндричну термостатовану комірку об'ємом 2мл3, яка була заповнена фізіологічним розчином, при 370С и рН 7,4. Хроноамперограму реєстрували протягом 30 хв при швидкості руху діаграмної стрічки 10 мм/с. Споживання кисню за хвилину розраховували за кривою спаду кисню в часі на 100 г тканини. Коефіцієнт розчинності кисню приймали рівним 0,024 мл·мл-1·атм-1 при 370С.
Дослідження вмісту в кістці мінеральних, органічних речовин і води проводили гравіметричним методом при 20-220С і відносній вологості 75-80%. На 1-му етапі за допомогою ''ТВ-500'' визначали масу вологого препарату з точністю ±1 мг. На 2-му етапі препарат висушували в сушильній шафі при 1050С до стабільної маси та визначали його “суху масу”. На 3-му етапі препарат спалювали в муфельній печі при 7000С не менше ніж 5 год і визначали його “озолену масу”. Кількість води в препараті розраховували як різницю між масою вологого й сухого препарату, органічних речовин - як різницю між масою сухого й озоленого препарату. Кількість мінеральних речовин прирівнювали до вмісту золи. Щільність вологого та сухого препаратів кістки розраховували за допомогою розподілу його маси на об'єм.