Автор особисто опрацював фахову літературу за темою дисертації, виконав експериментальні дослідження і провів статистичний аналіз одержаних результатів.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені і обговорені на: конференції молодих вчених біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Карабіна (2005), І Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ біології» (Львів, 2005), засіданні Харківського біохімічного товариства (2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), ІV з'їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 робіт, у тому числі 4 статті у фахових наукових журналах та 3 в матеріалах і тезах конгресів, з'їздів, конференцій, які повністю відбивають основний зміст дисертації.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 148 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, висновків. Список використаних літературних джерел містить 218 найменувань. Робота ілюстрована 21 рисунком і 14 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури представлені дані про структуру, властивості і біологічну дію граміцидину S на бактеріальні і тваринні клітини. Розглянуті сучасні уявлення про основи його біологічної активності, а також не з’ясовані ще молекулярні механізми взаємодії антибіотика з нативними мембранами.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження проведені на тромбоцитах і еритроцитах здорових донорів і людей з серцево-судинними захворюваннями (атеросклероз і післятромбофлебічний синдром) обох статей віком 41 – 60 років.
Збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) та еритроцитарну масу одержували з крові методами [MacCenzieR.D., 1974] та [GrossmanS.J. andJollowD.J.,1992] відповідно. В усіх експериментах кількість клітин в ЗТП становила, в середньому, ~ 2,5 Ч 108 / мл, а в суспензії еритроцитів ~ 106 / мл. Кількість клітин у зразках підраховували в камері Горяєва. Тромбоцити фарбували метиленовим синім.
Отримані зразки зберігали у скляному силикованому посуді і всі вимірювання проводили на протязі 3 – 5 годин після приготування і не пізніше 24 годин після отримання крові.
Агрегацію тромбоцитів викликали додаванням до 0,9 мл ЗТП 0,1 мл розчину АДФ (Reanal, Угорщина) в концентрації 2 Ч 10 -5 М.
Для дослідження впливу граміцидину S на агрегацію тромбоцитів і гемоліз еритроцитів 2-% розчин антибіотика в етанолі (фармацевтичний препарат, Фармахим, РФ), розводили розчином 0,15 М NaCl, рН 7,4 в 30 – 50 разів до концентрації, в якій він додавався до ЗТП та суспензії еритроцитів. Попередні контрольні досліди показали, що етанол в концентрації до 1% не впливає на агрегацію тромбоцитів і гемоліз еритроцитів.
Процеси агрегації тромбоцитів і гемолізу еритроцитів в різних експериментах вивчали за змінами світлопропускання (Т), або оптичної густини (D) [Лопатин В.Н.,Седько Ф.Я.,1988]. Вимірювання проводили на фотоелектроколориметрі ФЕК-М з максимумами світло пропускання 540 нм для ЗТП і 670 нм для еритроцитарної суспензії. Запис кінетики досліджуваних процесів проводили автоматично на самописці ЕПП-09М.
За одержаними кінетичними кривими визначали ступінь і швидкість цих процесів. Ступінь агрегації і дезагрегації тромбоцитів та гемолізу еритроцитів розраховували, як різницю між початковими і поточними значеннями світлопропускання (∆Т), або оптичної густини (∆D) і виражали в абсолютних величинах. Для обох типів клітин швидкість досліджуваних процесів визначали за тангенсом кута нахилу дотичної до відповідної ділянки кінетичної кривої на її піввисоті. Для еритроцитів виміряли також час їх повного гемолізу.
По кривим швидкості гемолізу еритроцитів і дезагрегації тромбоцитів в діапазоні температур 40С- 440С за рівнянням Ареніуса розраховували енергії активації цих процесів.
Структурні властивості мембран тромбоцитів і еритроцитів змінювали шляхом індукції перекисного окислення ліпідів (ПОЛ). Для цього ЗТП і суспензію еритроцитів інкубували протягом 15 хв з 0.5 М аскорбінової кислоти і 12 мкМ солі Мору. Інгібування ПОЛ здійснювали розчином (50 мкг/мл) б - токоферолу в гексані (Sigma, США). Інтенсивність ПОЛ тромбоцитарних і еритроцитарних мембран оцінювали за накопиченням в зразках сполук малонового діальдегіду (МДА) по реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою. Концентрацію МДА розраховували на основі коефіцієнту його молярної екстинкції (е = 1,53 Ч 105 М-1 см-1 Ч л) за інтенсивністю поглинання при л = 532 нм [EsterbauerH., CheesemanK.H., 1990].
Концентрацію білка в зразках визначали за методом Лоурі [LowryO. еtal., 1955].
Тромбоцити також опромінювали г - випромінюванням 60Со дозами 2,58 Ч 10-4 Кл/кг і 6,45 Ч 10-3 Кл/кг на установці «Исследователь» при потужності випромінюваної дози в активній зоні 5,16 Ч 10-2 Кл/кг/хв.
Для зв’язування вільних іонів плазми Са2+ і Мg2+ ЗТП інкубували відповідно з ЕГТА і ЕДТА (Sigma, США) в концентраціях 0,05 – 2 мМ протягом 2 хвилин. Концентрацію Са2+ і Мg2+ в зразках виміряли на полум'яному спектрофотометрі СФП-1.
Процеси утвлрення і розпаду тромбоцитарних агрегатів контролювали мікрофотографічно цифровою камерою CannonEOS 300Dна поляризаційно – флуоресцентному мікроскопі мPOLAM-Lпри 100-кратному збільшенні.
Мембрани еритроцитів отримували за методом [GrossmanS.J., JollowD.J.,1992]. Ліпіди мембран еритроцитів екстрагували за методом [Bligh E.G., Dyer W.J., 1959].
Фракціонування загальних ліпідів проводили тонкошаровою хроматографією на силікагелевих платівках марки Sulufol UV 254 (Sklarny Kavalier, Чехія). Розподіл фосфоліпідів проводили методом тонкошарової хроматографії на платівках Silicagel
Wolem TLC (Германія).
Ідентифікацію ліпідів виконували за допомогою стандартів (“Sigma”, США). Кількісний вміст фракцій проведено відповідно до стандартних методик (Фіндлей Дж., Еванз У., 1990).
Якщо про це не зазначено спеціально, всі експерименти проводили при кімнатній температурі (t = 200С).
Для статистичної обробки результатів використовували критерій вірогідності Стьюдента та Манн-Уітні. Вірогідними вважали результати с р<0,05. Криві, що представлені на рисунках, є типовими для серії повторних дослідів (не менше, ніж три в кожній серії).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Дослідження впливу граміцидину S на інтактні тромбоцити.
З метою дослідження особливостей впливу граміцидину S на інтактні тромбоцити були вивчені часові залежності світлопропускання ЗТП в присутності різних концентрацій антибіотика. Динаміка світлопроскуння ЗТП після додавання до неї граміцидину S являє собою криву з максимумом (Рис.1). Збільшення світлопропускання, про яке свідчить висхідна частина кривої, є наслідком зміни розсіювачої здібності поверхні тромбоцитів, що відбувається за рахунок зміни їх розміру і форми. Цей ефект повністю аналогічний першій стадії дії класичних індукторів агрегації, коли зміни світлопропускання ЗТП виникають за рахунок активації тромбоцитів – їх набрякання, зміни форми і звільнення рецепторів до фібриногену. Їх взаємодія з молекулами останього утворює в подальшому фібриногенові містки, які з’єднують окремі тромбоцити в агрегати [SeissW., 1989; Blockmansetatal, 1995; ТomasiakM.etal., 2004].
Зниження світлопропускання ЗТП після досягнення максимуму (низхідна частина кінетичної кривої) відображає зворотний процес – частковий розпад агрегатів, що формуються під впливом індукторів, в умовах invitro[SeissW., 1989; Сабаль ?,?, Черенкевич ?,?, 1990; ТomasiakM.etal., 2007].
Таким чином, дія граміцидину S на інтактні тромбоцити аналогічна дії індукторів агрегації і полягає в зміні їх форми і активації.
Наступна дія індуктора агрегації АДФ на тромбоцити, що були активовані граміцидином S, призводить до подальшого розвитку агрегації (Рис.1). Але ступінь агрегації при постійній концентрації АДФ зменшується з підвищенням концентрації антибіотика (Табл..1). Це явище можна зрозуміти, виходячи з того, що існує критична концентрація граміцидину S, після котрої він починає руйнувати тромбоцити. Дійсно, як видно з рис. 1, при концентрації 7,8 мкмоль/л, шо відповідає 14,94 Ч106 молекул граміцидину S, які припадають на один тромбоцит, низхідна частина кінетичної кривої перетинає початковий рівень свїтлопропускання. Оскільки він відповідає нативним клітинам, негативна величина світлопропускання свідчить про руйнування частини тромбоцитів в ЗТП [LatimerP. etal, 1977]. Це і є причиною зменшення ступеня агрегації під дією АДФ. Час початку руйнування тромбоцитів зменшується з підвищенням вмісту граміцидину S в ЗТП після досягнення ним критичної концентрації (Табл.1).
Табл.1.
Концентраційні залежності впливу граміцидину S на зміни форми тромбоцитів і ступінь їх агрегації наступної дії АДФ.
| Показник | Концентрація граміцидину S, мкмоль/л | |||
| 5,4 | 6,2 | 7,8 | 9,1 | |
| Кількість молекул граміцидину S/ тромбоцит Ч106 | 13,01 ± 0,551 | 14,94 ± 0,629 | 18,79± 1,122 | 21,92 ± 1,538 |
| Максимальна зміна форми тромбоцитів після доданняграміцидину Sвідносно базового рівня - ∆Т,% | 6,38* ± 0,515 | 7,68*, **±0,608 | 6,0**±0,49 | 6,0± 0,49 |
| Максимальна зміна форми тромбоцитів через 7,5 хвилин після додання граміцидину Sвідносно базового рівня - ∆Т,% | 4,13*± 0,393 | 1,88*,**± 0,147 | -0,75*,**± 0,061 | -2,25*,**± 0,153 |
| Час початку руйнування тромбоцитів після додання граміцидину S, с | Не руйнуються | Не руйнуються | 392 | 254 |
| Ступінь агрегації тромбоцитів після послідовного додання граміцидину S і АДФ - ∆Т,% | 20,3*, ** ± 2,31 | 15,0*, **± 1,26 | 12,0* ± 0,98 | 11,6* ± 0,85 |
Примітка:* - вірогідно відносно мінімальної концентрації граміцидину S (р < 0,05)