** - вірогідно відносно попередньої температури (р < 0,05)
Індукція ПОЛ в мембранах тромбоцитів значно підвищує ступінь руйнування тромбоцитарних агрегатів під дією граміцидину S при всіх досліджених температурах. Однак в умовах експерименту вклад ПОЛ у кумулятивний ефект цього підвищення – сумісно з температурою – знижується з ростом останньої. Як видно з Табл. 5, при 100С він становить 112%, а при 360С – лише 12%. В усякому разі підвищення ступеня дезагрегації тромбоцитів може свідчити про полегшення вбудування антибіотика в клітинну мембрану за рахунок того, що окислення ліпідів приводить до порушення її структурної впорядкованості [MarshS.A., 2006] і, як слідство, зниження механічної міцністі.
Доданий до ЗТП б-токоферол, який інгібує процеси ПОЛ (Табл.5), діє протилежним напрямом і суттєво зменшує біологічну активність граміцидину S.
Табл.5.
Вплив індукованого ПОЛ та б-токоферолу на температурну залежність ступеня дезагрегації тромбоцитів (ДТ) при дії граміцидину S
| Показник | Умовиексперименту | Концентрація МДА,нмоль/109 тромбоцитів | Т0, С | |||
| 10 | 20 | 28 | 36 | |||
| ДТ, % | Контроль | 1,38 ± 0,15 | 15,0±1,62 | 21,2**±2,08 | 35,3**±2,64 | 39,1±3,21 |
| Індукція ПОЛ | 4,15*± 0,78 | 31,9*±2,75 | 35,0*, **±3,04 | 40,1*,**±3,35 | 44,0 ±3,80 | |
| б-токоферол | 0,97*± 0,11 | 23,6*± 2,21 | 18,1**± 2,51 | 26,0*,**± 2,63 | 23,9*± 2,94 | |
Примітка:* - вірогідно відносно контролю (р < 0,05)
** - вірогідно відносно попередньої температури (р < 0,05)
При цьому, починаючи з 20 0С, .рівень розпаду тромбоцитарних агрегатів навіть нижчій, ніж в контролі.
Розрахунки енергії активації розпаду тромбоцитарних агрегатів при дії граміцидину S показують, що під впливом ПОЛ ії величина суттєво знижується (Табл.6). .Таким чином, окислення ліпідів, що зменшує структурну впорядкованость плазматичної мембрани, водночас знижує і міцність зв’язування тромбоцитів між собою. Цей ефект полегшує антибіотику процес руйнування агрегатів. .
Табл.6.
Вплив індукованого ПОЛ на енергію активації дезагрегації тромбоцитів при дії граміцидину S
| Показник | Умови експерименту | Концентрація МДА,нмоль/109 тромбоцитів | Енергія активації, кДж/моль |
| Дезагрегація тромбоцитів | Контроль | 1,38 ± 0,05 | 415 ± 38 |
| Індукція ПОЛ | 4,15 ± 0,78* | 325 ± 27* |
Примітка:* - вірогідно відносно контролю (р < 0,05)
Дослідження впливу граміцидину S на гемоліз еритроцитів при дії фізичних і хімічних чинників.
В Табл. 7 наведені дані про залежність швидкості і повного часу гемолізуеритроцитів під дією граміцидину S при 200С. Згідно з отриманими результатами обидва показника гемолізу рівномірно зростають з підвищенням концентрації антибіотика. Найбільш цікавим, однак, у цих результатах є можливість порівняти кількість молекул граміцидину S, які, припадаючи на один еритроцит, викликають гемоліз, з кількістю його молекул на тромбоцит, що приводять як до руйнування індивідуальних клітин, так і їх агрегатів. В одних і тих же умовах ці величини складають (17,46±??)Ч109 і, відповідно (13,01 ± 0,55) Ч106 та (0,86 ± ??) Ч109 молекул антибіотика на клітину.
Табл..7.
Концентраційні залежності швидкості (V) і повного часу (t) гемолізу еритроцитів під дією граміцидину S
| Показник | Концентрація граміцидину S, , мкмоль/л | |||||
| 29 | 31 | 33 | 35 | 37 | 39 | |
| Кількість молекул граміцидину S / еритроцит Ч109 | 17,46± 0.873 | 18,67**± 1,103 | 19,87**± 1,205 | 21,08*±1,312 | 22,28*±1,428 | 23,49*± 1,508 |
| V, о.о./хвЧ103 | 33± 2,9 | 54*± 5,1 | 67*± 5,6 | 92*± 8,5 | 125*± 11,7 | 150*± 13,0 |
| t, хв | 15,0± 1,8 | 11.67*± 1,2 | 9,02± 0,77 | 8,0*± 0,063 | 6,67*± 0,59 | 5,17*± 0,43 |
Примітка:* - вірогідно відносно мінімальної концентрації граміцидину S (р < 0,05)
Це явище, очевидно, по-перше може бути пов’язано із значно більшими розмірами еритроцитів у порівнянні з тромбоцитами. Але важливішою причиною є, безумовно, різна будова мембран – питомий склад їх білковх та ліпідних компонентів, в обох типів клітин. Саме тому граміцидин S не тільки руйнує мембрану тромбоцитів, як і еритроцитів, але й виступає для перших в якості індуктора агрегації.
В той же час загальні особливості взаємодії граміцидину S з еритроцитами, які базуються на загальних же властивостях мембран будь-яких клітин, мають ті ж характерні риси, що і у випадку тромбоцитів.
З рис.5 видно, що час повного гемолізу еритроцитів знижується, а його швидкість збільшується з підвищенням температури. Декілька слабше, ніж у еритроцитів, але все ж виявляється прискорення гемолізу в облвсті фазових переходів ліпідів мембран.
Як і у випадку тромбоцитів індукція ПОЛ в мембранах еритроцитів збільшує, а його інгібування б – токоферолом – зменшує рівень гемолізу, що іде на протязі одного й того ж часу. під дією граміцидину S.
Сумісна дія підвищення температури і ПОЛ інтенсифікує гемоліз, але вклад цих складових у загальний процес неоднаковий (Рис. 6). ПОЛ змінює, в основному, хімічну структуру ліпідів, в той час, як підвищення температури – їх рухливість. Згідно Рис.6 в області температури тіла рухливість ліпідів відіграє важливішу роль у підвищенні біологічної активності антибіотика.
Вплив ПОЛ на гемоліз еритроцитів, однак, є суттевим. Розрахунки енергії активаціїповного гемолізу, приведені в Табл.8, свідчать, що ПОЛ значно знижує енергетичний бар’єр руйнування мембрани.
Порівняння енергії активації руйнування мембран еритроцитів з енергією активації дезагрегації (Табл.6) показує, що другий процес вимагає більшої енергії. Це може бути пов’язано з меншою доступністю ліпідів, вкритих глікокалісом, в мембрані тромбоцитів, більшим вмістом в ній білків, необхідністю для антибіотика, крім вбудовування в мембрану, розривати щей фібріногенові містки між клітинами.
Табл.8.
Вплив індукованого ПОЛ на енергію активації гемолізy еритроцитів за дією граміцидину S
| Показник | Умови експерименту | Концентрація МДА,нмоль/л | Енергія активації, кДж/моль |
| Гемоліз еритроцитів | Контроль | 5,1 ± 0,53 | 178 ± 23 |
| Індукція ПОЛ | 7,25 ± 0,72* | 109 ± 17* |
Примітка:* - вірогідно відносно контролю (р < 0,05)
Дослідження впливу ліпідного складу мембран еритроцитів на їх гемоліз за дією граміцидину S.
Дослідження залежності гемолізу за дії граміцидину Sеритроцитів здорових донорів і людей з порушеннямі ліпідного обміну, хворих на атероскдлероз і післятромбофлебічний синдром плоказало суттеу залежність стійкості клітинних мембран від їх ліпідного складу (Табл.9). Як видно, швидкість гемолізу еротрицотів вирогідно знижується із збільшенням питомої кількості холестерину і зниженням питомої кількості загальних фосфоліпідів.
Це явище можна пояснити так. На штучних фосфоліпідних мембранах показано [Овчинников Ю.А.,1987], що радікали амінокислотних залишки граміцидин S можуть взаємодіяти с фосфатними групами мембранних фосфоліпідів з утворенням ковалентних зв’язків. Очевидно, зниження відношення холестерин /фосфоліпіди в мембраніх еритроциту зменшує і кількість молекул антибіотика, які спроможні вбудуватися в неї, а тим самим гальмує процес руйнування клітини.
Табл. 9.
Вплив ліпідного складу мембран еритроцитів на швидкість їх гемолізу за дією граміцидину S
| Умови експерименту | Холестерин, % | Фосфоліпіди,% | Холестерин Фосфоліпіди | Швидкість гемолізу, о.о./хв |
| Контроль | 39,5±0,9 | 47,6±3,2 | 0,83 | 0,35 ± 0,062 |
| Післятромбофлебічний синдром | 44,9±1,4* | 40,5±2,6* | 1,10 | 0,29 ± 0,045 |
| Атеросклероз | 57,7±2,1* | 30,0±2,7* | 1,92 | 0,11± 0,016* |
Примітка:* - вірогідно відносно контролю (р < 0,05)
ВИСНОВКИ
1. У роботі із використанням оптичного методу досліджено концентраційні залежності дії граміцидину S на агрегацію тромбоцитів і гемоліз еритроцитів - як інтактних, так і в умовах модифікації плазматичних мембран г-опроміненням та біологічно активними сполуками в діапазоні температур 40С - 440С.
2. Доведено, що взаємодія граміцидину S з інтактними тромбоцитами призводить до їх набрякання і зміни форми, подібної до такої, що відбувається під впливом індукторів агрегації. Цей процесс є Са2+, Mg2+ - залежним
3. Уперше показано, що граміцидин S руйнує агрегати тромбоцитів, які утворюються під впливом індукторів агрегації, не руйнуючи при цьому плазматичну мембрану клітин.
4. На основі оцінки відношення: кількість молекул граміцидину S/тромбоцит, при яких настає активація тромбоцитів та руйнування їх агрегатів, показано , що її критична величина для першого процесу вища, ніж для другого.
5. Показано, що ступінь і швидкість дезагрегації тромбоцитів граміцидином S найбільші в області структурних фазових переходів ліпідів мембран (180С – 330С). При вищих температурах ці параметри дезагрегації знижуються, що свідчить про більшу стійкість агрегатів при температурі тіла.
6. Встановлено, що зменшення впорядкованості ліпідів у плазматичній мембрані тромбоцитів та еритроцитів при їх г-опроміненні чи перекісному окисленні ліпідів веде до полегшення вбудовування граміцидину S у мембрани, але, водночас, призводить й до зменшення міцності зв'язування антибіотика з нею.
7. Уперше показано, що біологічна активність граміцидину S по відношенню до еритроцитів залежить від вмісту холестерину та відношення холестерин/фосфоліпіди в мембранах. Його збільшення знижує гемолітичну дію антибіотика по відношенню до цих клітин.