Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи суттєво доповнюють існуючі уявлення про механізми розвитку дизрегуляторної патології, її вікові аспекти, конкретизують участь тимуса в патогенезі порушень адаптаційного імунітету та тих нейроімунних розладів, які є наслідком неповної глобальної ішемії мозку.
Отримані гістохімічні, морфологічні, морфометричні та біохімічні підтвердження впливу емоксипіну на перебіг нейроімунних розладів, супутніх ішемічно-реперфузійним пошкодженням головного мозку, свідчать про доцільність за даної патології не лише нейропротекторної терапії, але й імунокорегувальної, а вікові особливості ефектів препарату – про необхідність урахування віку при виборі імунокорегувальних засобів.
Нові наукові факти, отримані при виконанні дисертаційної роботи, можуть знайти використання при викладанні нормальної і патологічної фізіології, нервових хвороб, імунології, педіатрії, у роботі лабораторій науково-дослідних інститутів із відповідними науковими напрямами, при написанні підручників та монографій із зазначених галузей медицини.
Результати роботи впроваджено в навчальний процес кафедр фізіології та патофізіології Запорізького державного медичного університету, Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського, Буковинського державного медичного університету, м.Чернівці.
Особистий внесок здобувача. Автор самостійно здійснив підбір та аналіз літератури з проблеми дослідження, виконав усі експериментальні втручання на тваринах, провів статистичну обробку отриманих результатів, написав усі розділи дисертаційної роботи та публікації. Основні положення та висновки дисертації сформульовано спільно з науковим керівником.
Біохімічні, гістохімічні та морфологічні дослідження виконано за участі дисертанта.
В опублікованих зі співавторами наукових працях здобувачу належить експериментальний матеріал, статистична обробка, узагальнення результатів, підготовка до друку. У тій частині актів впровадження, що стосуються науково-практичної новизни, викладено фактичний матеріал автора.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації оприлюднено та обговорено на: ІУ Національному Конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004), науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій 200-річчю з дня заснування Харківського державного медичного університету "Від фундаментальних досліджень – до прогресу в медицині" (Харків, 2005), Навчально-методичній нараді завідувачів кафедр і курсів клінічної імунології та алергології і регіональній науково-практичній конференції України (Чернівці, 2006), ХІ Конгресі СФУЛТ (Полтава, 2006), ХLІX підсумковій науково-практичній конференції (Тернопіль, 2006), ХУІІ з’їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (Чернівці, 2006), Всеукраїнській науковій конференції "Актуальні питання вікової анатомії та ембріотопографії" (Чернівці, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць, із них 6 статей у фахових наукових журналах, 6 – у матеріалах конгресів і конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 211 сторінках, ілюстрована 74 таблицями, одним рисунком. Структура дисертації складається зі вступу, шести розділів, висновків і списку використаних джерел, який налічує 324 найменування вітчизняної та зарубіжної літератури. Бібліографічний опис джерел літератури та додатки викладені на 55 сторінках.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал і методи дослідження. Робота виконана на одно- та тримісячних самцях білих лабораторних щурів. Неповну глобальну ішемію мозку моделювали двобічним 20-хвилинним кліпсуванням загальних сонних артерій. Контрольним тваринам проводили розтин шкіри, сепарацію м’язів і виділення судин без порушення в них кровообігу. Усі оперативні втручання здійснювали під каліпсоловим наркозом (75 мг/кг маси тіла). Частині щурів у перші три хвилини по закінченні ішемічного періоду, потім щоденно, протягом 5 днів внутрішньочеревинно уводили емоксипін у дозі 5 мг/кг (Тимофійчук І.Р., 2003).
Усі втручання та забій тварин проводилися з дотриманням основних положень GСP (1996 р.), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину від 04.04.1997 р. та Гельсінської декларації Всесвітньої медичної асоціації про етичні принципи проведення наукових медичних досліджень за участю людини (1964-2000 р.) і Наказу МОЗ України №66 від 13.02.2006 р. Комісією з питань біоетики Буковинського державного медичного університету (протокол №23 від 13.12.2007 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено.
На кріостатних зрізах різних частин тимуса, забарвлених гематоксилін-еозином, за допомогою комп’ютерної системи цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина) вивчали структуру лімфоїдної популяції тимуса, абсолютну кількість клітин (на 1 мм2 площі залози) та відносну (%) щільність розподілу кожного класу клітин у межах окремих зон залози, морфометричні та денситометричні характеристики тимоцитів. Ідентифікація клітин в отриманому зображенні проводилася в автоматичному режимі за допомогою пакета прикладних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). Визначали морфометричні характеристики лімфоїдних клітин (площу, периметр, коефіцієнти форми, елонгації) та денситометричні параметри (абсолютну та питому оптичну щільність). Математичний класифікаційний аналіз проводили з використанням мікроскопа Axioskop (Zeiss, Німеччина) та системи цифрового аналізу зображення VIDAS 2.5 (Kontron Electronik, Німеччина). Виділено 9 класів клітин лімфоїдної популяції вилочкової залози: лімфобласти; лімфобласти з ознаками деструкції; великі лімфоцити; великі лімфоцити з ознаками деструкції; середні лімфоцити; середні лімфоцити з ознаками деструкції; малі лімфоцити; малі лімфоцити з ознаками деструкції; лімфоцити в стані апоптозу.
Інтенсивність флуоресценції катехоламінів у тимусі визначали за методом Фалька-Овмена в модифікації А.Ю.Буданцева (1978). У гомогенатах структурно-функціональних зон тимуса визначали вміст дієнових кон'югатів, малонового альдегіду (Магаляс В.М. та ін., 2001), активність супероксиддисмутази (Fried R. , 1975; Nashikimi N. et al., 1972), каталази (Королюк М.А. и др., 1988), глутатіонпероксидази (Мещишен И.Ф., 1991).
Результати досліджень оброблено на IBM-сумісному персональному комп’ютері з використанням пакета прикладних і статистичних програм VIDAS 2.5 (Kontron Electronik, Німеччина) та EXCEL із пакета MS Office 2000 (Microsoft Corp., США) і проаналізовано з використанням критерію Стьюдента. Статистично вірогідними вважали зміни при Р £ 0,05.
Результати досліджень та їх обговорення. Для розуміння патогенезу імунологічних порушень за умов ішемічно-реперфузійного пошкодження мозку важливим є вивчення змін, що виникають при цьому в імунній системі, зокрема, у центральному її органі - вилочковій залозі.
Згідно з нашими дослідженнями, у субкапсулярній та глибокій кірковій зонах тимуса одномісячних тварин неповна глобальна ішемія головного мозку підвищила сумарну щільність незмінених і деструктивних тимоцитів. У даних зонах залози тримісячних тварин за аналогічних умов сумарна щільність нормальних лімфоцитів зросла, а деструктивних – знизилася. Емоксипін у субкапсулярній зоні одномісячних щурів зменшував постішемічний приріст щільності нормальних та, особливо, деструктивних тимоцитів. Незважаючи на протилежне спрямування порушень щільності нормальних та деструктивних тимоцитів у цій зоні залози тримісячних щурів, емоксипін також частково нормалізував ці показники. У глибокій кірковій зоні тимуса одномісячних щурів препарат посилив вплив ішемії мозку на щільність нормальних тимоцитів, проте повністю нормалізував щільність деструктивних клітин, а в тримісячних – мав антиішемічний ефект, однак із деякими ознаками надлишковості дії.
Неповна глобальна ішемія головного мозку підвищила сумарну щільність незмінених тимоцитів у внутрішньочасточкових периваскулярних просторах тимуса щурів обох вікових груп та знизила щільність деструктивних тимоцитів у тримісячних. Емоксипін в одномісячних щурів запобігав підвищенню сумарної щільності нормальних тимоцитів та знижував щільність деструктивних, незважаючи на відсутність постішемічних змін останнього показника, що, ймовірно, можна пов’язати з недостовірним його підвищенням під впливом ішемії. У даній зоні тимуса тримісячних щурів емоксипін частково нормалізував щільність нормальних тимоцитів та повністю – клітин з ознаками деструкції.