специфічність виявлення Core Ag ВГС;
наявність осіб з циркулюючим антигеном у крові серонегативних по анти-ВГС;
часте (90,3%) виявлення Core Ag ВГС у сироватках крові з наявністю анти-ВГС і РНК ВГС;
пряма кореляція між концентрацією РНК ВГС і виявленням Core Ag ВГС;
Визначено, що Core Ag ВГС удається виявляти в 83% випадків (n=24) наступного дня після першого виявлення РНК ВГС і задовго (у середньому 26 днів) до появи анти-ВГС.
МЕТОДИ ВИЯВЛЕННЯ РНК ВГС. Сучасний етап лабораторної діагностики гепатиту С можна охарактеризувати як етап початку широкого застосування молекулярно - біологічних методів виявлення РНК ВГС. Переважна більшість методів виявлення нуклеїнових кислот було апробовано для виявлення РНК ВГС. Принципам конструювання діагностичних препаратів і їхньому застосуванню для детекції вірусних ДНК чи РНК присвячене значна кількість літературних оглядів, опублікованих як у вітчизняних, так і закордонних виданнях. Усі ці методи можна розділити на двох груп, в основі яких лежить застосування принципів гібридизації без ампліфікації обраної ділянки нуклеїнової кислоти та з їх ампліфікацією, що дозволяє значно підвищити здатність методу.
МЕТОД ГІБРИДИЗАЦІЇ заснований на з'єднанні мічених гібрідізаціонних зондів (генноінженерні чи синтетичні молекулярні структури, що містять у собі нуклеотидні послідовності, комплементарні обраним ділянкам РНК). Облік результатів здійснюють по інтенсивності сигналу, що надходить від мітки в складі комплексу, що утворився.
При гепатиті С цей метод виявлення РНК ВГС насамперед знайшов застосування для її ідентифікації безпосередньо в гепатоцитах, у тестах що позначаються - іn sіtu hіbіdіzatіon. Можливість безпосередньої детекції РНК ВГС у тканині дозволила знайти її в мононуклеарних клітках крові, клітках слинних залоз і інших тканин організму хворого гепатитом С (Моминалиев, 2000).
МЕТОД ГІБРІДІЗАЦІЇ, ЯКИЙ ЗАСТОСОВУВАЛИ ДЛЯ ДЕТЕКЦІЇ РНК ВГС, дозволяє продемонструвати наявність негативних (реплікативних) ланцюгів РНК ВГС, що свідчить про активну реплікацію вірусу.
Метод полімеразної ланцюгової реакції - у даний час найбільш широко застосовуваний методичний прийом, що лежить в основі практично всіх молекулярно-біологічних методів детекції РНК ВГС. Причому, визначення РНК ВГС можливе як у якісному, так і кількісному варіанті, що особливо важливо для призначення, моніторингу й оцінки ефективності застосовуваної терапії.
Як основні варіанти методу можна виділити:
полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР);
лігазну ланцюгову реакцію;
NASBA;
ТМА (Реакція транскрипційно-опосередкованої ампліфікації, Transcrіptіon-medіated amplіfіcatіon). У його основі лежить багатоцикловий процес, що нагадує природну реплікацію нуклеїнової кислоти, причому кожен цикл складається з послідовних етапів.
З досліджуваного матеріалу (сироватка, плазма крові, печінковий біоптат) виділяється РНК ВГС. З огляду на те, що нуклеїнова кислота ВГС представлена РНК, а для ампліфікації необхідна молекула кДНК, за допомогою ферменту - зворотної транскриптази, відбувається утворення одноланцюгових молекул кДНК ВГС. На наступному етапі до визначеної ділянки кожного з ланцюгів кДНК ВГС приєднуються т. з. праймери - короткі олігонуклеотиди, комплементарні відомим нуклеотидним послідовностям. Порівняння первинної структури 5'UTR області геному різних ізолятів ВГС виявило їхню незначну мінливість (між генотипами, гомологія нуклеотидів - 92-98%, а у середині генотипу 98-99%).
Далі, за допомогою ферменту ДНК-залежної ДНК полімерази відбувається синтез нових ділянок ДНК. В даний час як джерело цього ферменту найчастіше використовують бактерії Thermophіlus termus (Tth-полімераза) чи Thermophіlus aquatіcus (Taq-полімераза). Володіючи термостабільністю в присутності іонів марганцю і магнію, цей фермент може бути одночасно використаний для синтезу комплементарних одноланцюгових молекул кДНК ВГС і ампліфікації обраних ділянок кДНК. На завершальному етапі одного циклу реакції, за допомогою ДНК полімерази відбувається синтез нових ланцюгів комплементарних кДНК ВГС. Багаторазове повторення циклів реакції призводить до накопичення фрагментів кДНК ВГС, що можливо зареєструвати за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з наступною візуальною детекцією чи із застосуванням гібридизації з олігонуклеотидними зондами, що збільшує чутливість і специфічність застосовуваних діагностичних препаратів. Застосування праймерів, мічених ферментами, дозволяє проводити облік результатів ПЛР за допомогою імуноферментного аналізу.
ЛІГАЗНА ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ виявлення РНК BГ.(LCR).
Метод заснований на здатності ферменту "ДНК- залежної ДНК-лігази" зшивати (лігувати) розриви фосфодіефірного зв'язку в ДНК у присутності АТФ і іонів Mg2+. Так само як і при проведенні "класичної" ПЛР для виявлення РНК ВГС, перший етап LCR - зворотна транскрипція з одержанням кДНК ВГС. Далі ДНК-лігаза здійснює зв'язування двох пар праймерів (комплементарних 5' некодованій зоні РНК ВГС), що надалі ампліфікуються. Детекція продуктів ампліфікації LCR здійснюється за допомогою обліку реакції антитіло-антиген-антитіло. Кожний із двох праймерів мітиться різним гаптеном. Перший з них захоплюється антитілами, адсорбованими на мікрочастинках. Після процедури промивання за допомогою другої пари антитіл, мічених флуоресцентною міткою, відбувається їхня виборча взаємодія з гаптеном в ампліфікаційному продукті з наступним проведенням субстратної реакції й обліком на флюориметрі.
Чутливість цього методу складає близько 200 копій РНК ВГС у мл, що дозволяє його використовувати для рішення різних клініко-діагностичних задач.
NUCLEІC ACІDS SEAQUENCENCE AMPLІFІCATІON - NASBA - метод детекції РНК ВГС заснований на одночасній дії трьох ферментів: зворотної транскриптази вірусу мієлобластоми птахів, РНК-ази Н и РНК-полимерази Т7. На відміну від RT PCR на першому етапі не проводиться зворотна транскрипція РНК ВГС. За допомогою використаних ферментів вдається одержати більш 109 копій ділянки кДНК ВГС протягом 90 хвилин. Можливість проведення реакції при невеликих температурах (+41 С) значно спрощує роботу і дозволяє відмовитися від устаткування, що забезпечує циклічні зміни високих температур. Облік результатів реакції здійснюється за допомогою електрохемілюмінісценції. Незважаючи на те, що по своїй чутливості NASBA близька до RT PCR, метод широко не використовується для виявлення РНК ВГС. В даний час проводиться розробка варіанту методу, що сполучить принципи проведення NASBA і "Real-tіme RT PCR".
КІЛЬКІСНЕ ВИЯВЛЕННЯ РНК ВГС. Для оцінки концентрації РНК ВГС застосовують кількісний варіант ПЛР. Спочатку концентрацію РНК ВГС намагалися охарактеризувати порядковими величинами, наприклад "+","++" і т. д., що візуально відбивають інтенсивність смуг, отриманих при електрофорезі продуктів ампліфікації, чи ж методом кінцевих розведень, по наявності позитивного результату в кінцевій крапці титрування. Труднощі стандартизації всіх етапів ПЛР не дозволяють об'єктивно оцінити концентрацію РНК ВГС, що приводить до істотних помилок трактування отриманих результатів [Масалова, 2000].
В даний час результати дослідження виражають у кількісних одиницях: кількість копій РНК ВГС, що містяться в 1 мл, в абсолютному чи логарифмічному вираженні (log 10). Виходячи з того, що концентрація виявленої РНК ВГС відбиває кількість вірусних часток, даний показник позначають як "вірусний еквівалент (eq)", з додаванням приставки k (кілограм, тисяча) чи М (мільйон). Ще одним способом вираження кількості вірусних часток є їхні вагові еквіваленти. Комітет експертів ВООЗ по біологічній стандартизації виготовив "міжнародний стандартний зразок", що містить РНК ВГС (ліофільно висушена сироватка крові, що містить РНК ВГС 1-го генотипу), концентрація якої виражена в міжнародних одиницях (ІU/m).
Спеціальні коефіцієнти дозволяють перераховувати отримані показники концентрації в міжнародні одиниці.
Для визначення концентрації РНК ВГС застосовують практично усі варіанти ПЛР. При цьому до діагностичних препаратів пред'являється ряд специфічних вимог, найважливішим з який є лінійність результатів, тобто збільшення сигналу реєстрованої реакції при збільшенні концентрації РНК ВГС у досліджуваному зразку. Застосування внутрішніх стандартів з різним вмістом РНК ВГС дозволяє уникнути багатьох методичних помилок, що можуть відбитися на кінцевому результаті реакції.
ПЛР У РЕАЛЬНОМУ ЧАСІ ("Real-tіme RT PCR") - один з найбільш перспективних варіантів кількісного методу виявлення РНК ВГС. Принцип методу полягає в здатності гідролізувати послідовності кДНК у напрямку 5'-і-і 3'. У реакції застосовується спеціальний зонд, мічений двома флуоресцентними барвниками, що мають близькі максимуми поглинання і флюоресценції. При наявності продуктів ампліфікації Tag-полімераза розщеплює зонд, що приводить до запобігання переносу енергії від однієї молекули барвника до інший, і тим самим запобігає вихіду кванта світла. Спеціальний прилад здійснює облік реакції і математичне моделювання кінетики флюоресценції на кожнім етапі реакції, що дозволяє одержати інформацію про вихідну концентрацію РНК ВГС.
Відмінною рисою "ПЛР у реальному часі" вважають можливість одержувати інформацію про наявність РНК ВГС безпосередньо в процесі реакції, що дозволяє зменшити час аналізу в сполученні з високою чутливістю і лінійністю одержуваних результатів. [Bukh, 2000].
МЕТОДИ ГЕНОТИПУВАННЯ РНК ВГС. Визначення приналежності ВГС до визначеного генотипу і субтипу знайшло своє застосування для рішення не тільки чисто наукових, але й практичних питань. Наприклад: пошук джерела інфекції під час спалахів гепатиту С чи прогнозування ефективності застосовуваної терапії.
"Золотий стандарт" генотипування ВГС - безпосереднє визначення первинної структури РНК ВГС із його наступним філіпченковим аналізом, що дозволяє чітко охарактеризувати даний ізолят вірусу [Kondo, 1993].