Вміст імуноглобулінів у випробуваній плазмі визначали каліброваною кривою, яку будували на напівлогарифмічному папері таким чином: по осі абсцис відкладали діаметри кілець стандартної сироватки. По осі ординат - відома кількість імуноглобулінів, що містяться у відповідному образі стандартної сироватки, помножене на 3. Отримані крапки з'єднували. Таким способом будували калібровані криві окремо для кожного класу імуноглобулінів. Якщо по кожному класу тестується одночасно велика кількість зразків плазми (реально до 960) на одночасно приготовлених пластинах агару, то за умови стандартного часу, що витримується чітко, інкубації всіх пластин для даного класу імуноглобулінів калібрована крива залишається незмінної для усіх видів пластин.
Для визначення рівня імуноглобулінів у випробуваній плазмі на осі абсцис, відкладається діаметр кільця преципітації даної плазми, відновлювали перпендикуляр до пересікання з калібровочною кривою, крапку перетинання проектували на осі ординат і відраховували вміст імуноглобулінів відповідного класу.
Визначення вмісту імуноглобулінів
Пластини, покриті шаром агару з моноспецифічною антисироваткою, готували для аналізу всіх 960 зразків плазми і зберігали у холодильнику при + 8°С в герметично закритому поліетиленовому пакеті зі зволоженням. У день доцільно ставити 480 зразків плазми. Прорахунок результатів проводять з використанням бінокулярної лупи Результати перераховували на каліброваній.
Виділення плазми для тестування імуноглобулінів
Планшети-штативи, у яких знаходяться трубочки з кров'ю, центрифугували 10 хвилин при 400 g. Після цього частину трубочки, що містить плазму, відрізали і переносять в інший аналогічний планшет-штатив, що упаковується і зберігається в морозильній камері до визначення вмісту імуноглобулінів.
2.3 Постановка біохімічних тестів
Визначення кількості білірубіна у сироватці крові за методом Йендрашика-Клеггорна-Грофа
Метод використовується для визначення загального і прямого білірубіна в сироватці крові
Принцип методу: діазотована сульфанілова кислота взаємодіє з білірубіном сироватки крові з утворенням комплекса рожево-фіолетового кольору, інтенсивність фарбування якого пропорційна концентрації білірубіна та вимірюється фотометрично. В присутності акселераторів (кофеїновий реактив) визначається загальний білірубін (вільний та зв’язаний), а при їх відсутності – тільки прямий (зв’язаний) білірубін.
Склад набору:
Реагент № 1 Кофеїновий реактив
Кофеїн 52 ммоль/л
Натрій оцтовокислий 184 ммоль/л
Натрій бензойнокислий 104 ммоль/л
Реагент № 2 Сульфанілова кислота
Сульфанілова кислота 29 ммоль/л
Соляна кислота 170 ммоль/л
Реагент № 3 Азотна кислота (4 мл) 72 ммоль
Діазореагент. Перед роботою змішати 10 частин реагента 2 з 0,3 частинами реагента №. 3.
Хід роботи: Внести в пробірки сироватку і реагенти за схемою:
Сироватка0,250,250,25
0,9% розчин NaCl0,252,00,5
кофеїновий розчин1,75-1,75
Диазореагент0,250,25-
Загальний об’єм2,52,52,5
Вміст пробірок ретельно перемішати і залишити при кімнатній температурі для розвитку фарбування. Через 5-10 хв після додавання діазореагента виміряти екстінкцію дослідної проби на прямий білірубін, а через 20 хв – на загальній білірубін. Фотометру вати проти контрольної проби при довжині хвилі 500-560 нм (зелений світлофільтр) в кюветі з довжиною оптичного шляху 5 мм.
Розрахування загального і прямого білірубіна проводять по калібровочному графіку. Непрямий білірубін розраховували по різниці між вмістом загального і прямого білірубіна.
Визначення тимолової проби 300 у сироватці крові
Принцип метода: сироваткові β-глобуліни та ліпопротеїни осаджувалися при рН 7,55 тимоловим реактивом. В залежності від кількості та взаємного відношення окремих білкових фракцій при реакції виникає помутніння, інтенсивність якого вимірювали турбідіметрично.
Реактиви:
Концентрований розчин тимола17 мл
Буфер ТРІС 11 ммоль/л; малонова кислота 3,36 ммоль/л; тимол 6,66 ммоль/л.
Калібровочний розчин 111 мл
Сірна кислота 2,5 моль/л
Калібровочний розчин 25 мл
Барій хлористий 48 ммоль/л
Склад реакційної суміши:
Буфер ТРІС, рН 7,55 (25оС)0,160 ммоль/л
Тимол0,098 ммоль/л
Співвідношення сироватка/ реакційна суміш 1:61
Приготування розчинів:
№1У колбу на 1000 мл налити 900 мл дистильованої води і при постійному перемішуванні магнітною мішалкою поступово додавали 15 мл реактива 1. розчин доповнюют дистильованою водою до мітки і перемішували ще 10 хвилин.
№2У мірну колбу вмістом 250 мл піпеткою поміщували 10 мл реактива 2. доливали охолодженою до +8оС водою до мітки і перемішували.
№3У мірну колбу вмістом 50 мл піпеткою поміщували 1,5 мл реактива 3 і доливали до мітки реактивом 2, охолодженим до 10оС. Перемішували.
Проведення аналізу:
Довжина хвилі (620-660 нм), кювета 1 см, температура +15+25оС.
У двох пробірках змішували розчин 1 у співвідношенні 60+1 з сироваткою чи фізрозчином. У наступній пробірці змішували фізрозчин у співвідношенні 60+1 із сироваткою (контрольній розчин 2) – наприклад 3 мл фізрозчину і 0,05 мл сироватки. Перемішували і залишали на 30 хв. Потім знов перемішували і вимірювали оптичну щільність проби А проти контрольного розчину 1
Калібрували проти контрольного розчину 2.
Калібровки:
№ Проби Розчин 2Розчин 3Одиниці помутнінняS-H
4,51,55
3,03,010
1,54,515
-6,020
Визначення амінотрансферази АЛТ у сироватці крові
Таблиця 1
Методика визначення АЛТ
| Відміряти (мл) | Проба | Контрольний розчин | |
| Реактив 4 Фізіологічний розчин | 0,25 | 0,25 0.05 | |
| Попередньо інкубували протягом 3 хв. при 37 С. | |||
| Сироватка крові | 0.05 | 1 | |
| Інкубували точно 60 хв. при 37 С | |||
| Реактив 2 | 0.25 | 0.25 | |
| Перемішували і залишавали стояти 23 хв. при 15-25 C. | |||
| Розчин NaOH | 2,50 | 2.50 | |
| Перемішували и через 10 хвю вимірювали оптичну щільність проби проти контрольного розчину (А). | |||
Принцип методу
Аланін-амінотрансфераза (L-аланін 2-оксоглутарат амінотрансфераза, каталізує реакцію між L-аланіном і 2-оксоглутаратом. У результаті якої вони перетворювалися а L-глутамат і сіль піровіноградної кислоти. Визначення засноване на вимірі оптичної щільності гідразонів 2-оксоглутаровой і піровіноградної кислот у лужному середовищі. Гідразон піровіноградної кислоти має більш високу оптичну щільність.
Реактиви
1 Еталонний розчин(3 мл)
натрій піровінограднокислий 2 ммоль/л
2,4-дінітрофенілгідразин(100 мл)
розчин 1 ммоль/л у HCl 1 моль/л
Натрій гідроокис (1 флакон)
Субстрат АЛА(2 х 50 мл)
фосфатний буфер 0.1. моль/л,
DL-альфа-аланін 02 моль/л,
2-оксоглутарат 2 ммоль/л
Склад інкубаційної суміші
Фосфатний буфер рн 7.4 (25 С) 83,0ммоль/л
01-альфа-аланін 166.0ммоль/л
2-оксоглутарат 1,7ммоль/л
Співвідношення сироватка крові/інкубаційна суміш 1/6
Визначення амінотрансферази ACT у сіроватці крові
Таблиця 2
Методика визначення АСТ
| Відміряти (мл) | Проба | Контрольний розчин |
| Реактив 4 Фізіологічний розчин | 0,25 | 0.25 0.05 |
| Попередньо інкубували протягом 3 хв. при 37 С. | ||
| Сыворотка крови | 0.05 | - |
| Інкубували точно 60 хв. при 37 С | ||
| Реактив 2 | 025 | 025 |
| Перемішували і залишавали стояти 20 хв. при 15-25 C. | ||
| Розчин NaOH | 230 | 230 |
| Перемішували и через 10 хвю вимірювали оптичну щільність проби проти контрольного розчину (А). | ||
Принцип методу
Аспартат-амінотрансферази (L-acпартат. 2-оксоглутарат амінотрансфераза каталізує реакцію між L-аспартатом і 2-оксоглутаратом у результаті якої вони перетворювалися а L-глутамат і оксалацетат. Визначення засноване на вимірі оптичної щільності гідразонів 2-оксоглутаровой і піровіноградної кислоти в лужному середовищу. Гідразон піровіноградної кислоти, що виникає при мимовільному декарбоксилюванні оксалацетата, має більш високу оптичну щільність.
Реактиви
1Еталонний розчин(3 мл)
натрій піровінограднокислий 2 ммоль/л
2,4-динитрофенилгидразин(100 мл)
розчин 1 ммоль/л в АЛЕ 1 моль/л
3Натрій гідроокис(1 флакон)
4Субстрат АСТ(2 х 50 мл)
фосфатний буфер 0,1 моль/л,
L-аспартат 0,1 моль/л, 2-оксоглутарат 2 ммоль/л
Склад інкубаційної суміші
Фосфатний буфер рн 7.4 (25 С)83.0 ммоль/л
L-аспартат83.0 ммоль/л
2-оксоглутарат1,7 ммоль/л
Співвідношення сироватка крові/інкубаційна суміш1/6
Готування робочого розчину Розчин гідроокису натрію
У мірній колбі місткістю 1000 мол розчиняли у дистильованій воді уміст флакона з Реактивом с. Стійкість: розчин стійкий
Проведення аналізу
Довжина хвилі(500-530) нм
Кювету1 см
Температура інкубації(37+- 0.1) С
Реактив 4 перед аналізом нагрівали до (37 ± 0.1) С
3. Результати та обговорення
Нами проводилося вивчення ефективності введення в комплексне лікування гепатиту С імуномодулюючих препаратів. Індуктори ІФН, такі як аміксин та циклоферонстимулюють вироблення власних інтерферонів, які не володіють антигенністю, їх рівень не досягає рівня, здатного проявляти ушкоджуючи дію на організм, тому вони мають менше побічних ефектів. Критерієм підбору імуномодулюючих препаратів служить чутливість і ступінь зв'язування з імунними клітинами.
Проводилося вивчення імунних показників: Т - клітинного імунітету, гуморального імунітету, фагоцитарної активності нейтрофілів, цитотоксичної активності НK і печінкових проб (АЛТ, АСТ, тимолової проби і білірубіна) у 35 хворих на гепатит С (табл. 3, 4, 5, 6).
Таблиця 3
Показники клітинного імунітету у хворих на ХГС, %
| Варіанти | Лейк., *106 | Лімф. | Тлімф | Тх | Тс | Тк | Влимф | Фагоц. активність |
| При застосуванні аміксину | 5,47 | 28,2 | 63,8 | 52,3 | 11,2 | 47,8 | 12,67 | 51 |
| При застосуванні циклоферону | 5,07 | 29 | 58,9 | 49,6 | 12,6 | 41,5 | 9,38 | 50,15 |
| До лікування | 4,2 | 21,4 | 61,2 | 54,5 | 6,7 | 34,6 | 15,63 | 63 |
| Норма | 4,0-8,0 | 19-37 | 55-70 | 40-60 | 10-20 | 30-50 | 6-15 | 40-95 |
Спочатку ми отримали дані до лікування, які становили: лейкоцити 4,2*106 кл/л, з них кількість лімфоцитів складала 21,4% (Т-лімфоцити 61,2%, з них Тх – 54,5%, Тс – 6,7%, Тк – 34,6%; В-лімфоцити 15,63%), фагоцитарна активність – 63%.