Пенициллы - продуценты пенициллина являются типичными аэробами и требуют для своего роста и развития наличия кислорода. Для получения высокопродуктивного посевного мицелия наряду с оптимальной питательной средой необходимо обеспечить и достаточное снабжение гриба. В процессе производства пенициллина выращивание посевного мицелия осуществляют при непрерывном перемешивании и бесперебойной подаче воздуха в аппараты в количестве 1,2-1,5 объема воздуха на 1 объем среды в минуту.
3.2.2 Процесс ферментации
Ферментация является основной стадией в производстве пенициллина, на которой формируется целевой продукт. В промышленности применяется метод глубинной ферментации, при котором культура микроорганизма выращивается в питательной среде, заполняя весь ее объем. У различных штаммов потребность в источниках питания неодинакова. В связи с этим состав сред не является постоянным и универсальным для всех продуцентов, образующих пенициллин, и меняется с появлением новых штаммов.
Ферментационная среда должна быть составлена таким образом, чтобы развивающаяся культура, потребляя питательные вещества и выделяя продукты обмена, сама создавала необходимые условия и осуществляла переход от фазы роста мицелия к фазе пенициллинообразования. Желательно, чтобы вторая фаза была более продолжительной и чтобы процесс ферментации прекращался до наступления автолиза.
Для этого, как и при выращивании посевного материала необходимо одновременное присутствие в среде как легко-, так и трудноусвояемого углевода. Легкоусвояемый углевод обеспечивает быстрый рост и образование обильной биомассы; трудноусвояемый углевод создает условия, благоприятные для биосинтеза антибиотика.
При промышленном биосинтезе пенициллина наибольшее распространение в качестве легкоусвояемого углевода получила глюкоза или гидрол. Трудноусвояемым углеводом является лактоза. Лактоза является единственным углеводом, обеспечивающим полноценное протекание фазы пенициллинообразования. Высокий выход антитибиотика получают только при наличии в среде лактозыв качестве основного источника углевода. Лактоза находится в культуральной жидкости на протяжении всего процесса ферментации, благодаря чему мицелий обеспечен сахаром, биомасса в течение пенициллинообразования медленно растет, и накопление антибиотика достигает максимального уровня.
В состав ферментационных сред входит органический и минеральный азот. Отличным источником органического азота считается кукурузный экстракт, но он может быть с успехом заменен пшеничным экстрактом, различными жмыхами, соевой мукой, глютеном и другим растительным сырьем, богатым азотом.
Источником минерального азота обычно служат нитрат аммония, сернокислый аммоний и некоторые другие соли. При ассимиляции грибом аммонийного азота этих солей освобождаются анионы кислот, которые способствуют некоторому закислению среды.
Исключительно важную роль в обмене веществ клетки играет фосфор, который необходим не только для нормального роста и развития гриба, но и для осуществления самого процесса биосинтеза пенициллина. Для образования пенициллина требуется значительно более высокая концентрация фосфора в среде, чем для роста гриба.
Обязательным компонентом ферментационной среды является сера, входящая в состав важнейших аминокислот и ферментов. Сера необходима еще и потому, что она входит в состав молекулы пенициллина. В питательные среды сера вносится в виде солей серной кислоты и гипосульфита.
Из других элементов, необходимых для нормальной жизнедеятельности гриба и образования антибиотика, следует отметить калий, магний, цинк, железо, марганец, медь.
Также необходимо присутствие предшественников в среде. Предшественниками называются вещества, непосредственно включающиеся в молекулу получаемого продукта. Предшественником бензилпенициллина является фенилуксусная кислота (ФУК) или ее производные - фенилацетамид (ФАА), фенилэтиламин, фенилацетилглицин и другие вещества. Предшественником феноксиметилпенициллина является феноксиуксусная кислота (ФОУК). Оптимальная концентрация предшественника в среде устанавливается в зависимости от эффективности его использования для биосинтеза пенициллина данным штаммом.
Для биосинтеза пенициллина наиболее благоприятно нейтральное значение рН. Для поддержания в культуральной жидкости определенного уровня рН рекомендуется регулировать его с помощью автоматического добавления кислоты или щелочи либо путем установления правильного соотношения компонентов среды. В синтетических средах в качестве регуляторов рН чаще всего применяют органические кислоты, в комплексных средах - мел. Своеобразным регулятором рН при промышленном получении пенициллина является кашалотовый жир, который добавляется в среду в процессе ферментации как пеногаситель.
Для получения максимального выхода пенициллина основные компоненты среды должны входить в ее состав в строго определенных соотношениях и концентрациях. Состав некоторых сред, применяемых в производстве пенициллина представлен в таблице 2.
Таблица 2 – Состав сред, применяемых для получения пенициллина
| Компоненты | Среда | ||
| кукурузная | жмыховая | жировая | |
| Кукурузный экстракт | 2,0 – 3,0 | - | 2,0 – 3,0 |
| Жмыхи (арахисовый, подсолнечный, соевый и др.) | - | 2,0 – 4,0 | - |
| Лактоза | 5,0 | 5,0 | 1,0 |
| Глюкоза или гидрол | 1,5 | 1,5 | 1,5 |
| Кашалотовый жир или растительные масла | 0,5 – 0,1 | 0,5 – 0,1 | 2,5 – 3,5 |
| Азотнокислый аммоний | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
| Сернокислый натрий | 0,05 | 0,05 | 0,05 |
| Фосфорнокислый калий однозамещенный | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
| Сернокислый магний | 0,025 | 0,025 | 0,025 |
| Серноватистокислыый натрий (гипосульфит) | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| Мел | 0,5 – 1,0 | 0,5 – 1,0 | 0,5 – 1,0 |
| Предшественник | 0,3 – 0,4 | 0,3 – 0,4 | 0,3 – 0,4 |
Основными показателями, свидетельствующими об окончании ферментации, являются полное исчезновение углеводов в культуральной жидкости и прекращение биосинтеза антибиотика. Процесс ферментации в производственных условиях осуществляется при температуре 26±10С и продолжается обычно 120-125 часов.
Интенсивность биосинтеза пенициллина зависит от количества мицелия, образуемого в процессе ферментации. Большая биомасса образует больше пенициллина, поэтому содержание углеводов, азота, фосфора и серы в среде должно быть достаточно высоким, чтобы обеспечить максимальное образование мицелия. Однако большая биомасса еще не гарантирует высокого выхода антибиотика. Гриб необходимо обеспечить не только достаточным количеством питательных веществ, но и необходимым количеством кислорода. Питание гриба и аэрация являются двумя сторонами одного процесса – чем больше питательных веществ в среде, тем больше требуется кислорода для их окисления. С другой стороны, повышение концентрации питательных веществ в среде ведет к увеличению биомассы, для дыхания которой требуется пропорционально большее количество кислорода. Состав питательной среды и аэрация взаимообусловлены. Максимальное количество пенициллина может быть получено только на средах с высокой концентрацией компонентов в условиях достаточного снабжения культуры растворенным кислородом.
Важным условием успешного проведения процесса биосинтеза пенициллина является строгое соблюдение условий асептики, так как попадание посторонних микроорганизмов может резко снизить выход антибиотика. Многие распространенные микроорганизмы способны образовывать фермент пенициллиназу, расщепляющий пенициллины. Попадание даже небольшого числа бактерий, способных вырабатывать пенициллиназу, приводит к полной инактивации пенициллина, в связи чемследует уделять особое внимание стерильности питательных сред, воздухаи вспомогательных материалов.
Необходимость обеспечения условий стерильности процессов при технологических связях агрегатов между собой коллекторными системами загрузки питательных сред, передачи посевного материала из инокуляторов в ферментаторы накладывает более высокие требования к уровню автоматизации этих процессов.
3.2.3 Фильтрация
Обычно для отделения мицелия от культуральной жидкости применяют вакуум-барабанные фильтры непрерывного действия. Фильтрацию начинают до начала автолиза мицелия, поскольку при фильтрации автолизированной культуры мицелий не образует плотной пленки на фильтрующей поверхности барабана, а налипает в виде отдельных тонких комков, которые сами не отходят в зоне «отдувки» фильтра, и их приходится удалять вручную. При этом продолжительность фильтрации увеличивается в 2 - 3 раза, выход фильтрата резко падает, а сам фильтрат получается очень мутным.
Необходимо тщательно соблюдать условия, препятствующие разрушению пенициллина во время фильтрации, - охлаждение нативного раствора до 4-6°С и систематическая (после каждой загрузки) обработка фильтра, коммуникаций и сборников антисептиками, например хлорамином. Фильтр также должен систематически стерилизоваться острым паром.
3.2.4 Предварительная обработка нативного раствора
Нативный раствор (фильтрат культуральной жидкости) представляет собой более или менее мутную, окрашенную в желто-коричневый или зеленовато-коричневый цвет жидкость. Величина рН среды в зависимости от штамма продуцента, состава среды и продолжительности процесса ферментации обычно колеблется от 6,2 до 8,2.
Очень важной характеристикой нативного раствора является содержание в нем белковых веществ, определяемых осаждением трихлоруксусной кислотой или другим соответствующим методом.