В случае флуоресцентной детекции пробирка не открывается и теоретически вероятность контаминации близка к нулю, однако возможность ее открытия не исключена. Поэтому лучше, если амплификация и детекция будут проводиться в отдельной комнате, тогда в случае непредвиденной ситуации контаминированной окажется одна комната.
Еще одна ошибка, приводящая к контаминации образцов, связана с неаккуратным обращением как с клиническими пробами, так и с положительными контрольными образцами и стандартами. Некоторые специалисты лаборатории с целью экономии при внесении в большое количество пробирок одного и того же вещества используют один наконечник. Это возможно, если пробирки пустые или их содержание одинаково (подготовка амплификационных пробирок). Однако, если в пробирке находится образец, как, например, при пробоподготовке, то при внесении даже одного и того же раствора в разные пробирки увеличивается риск переноса ДНК - так называемая кросс-контаминация. С целью предотвращения кросс-контаминации также рекомендуется для внесения образцов, потенциально содержащих ДНК, использовать наконечники с фильтрами.
Помимо этого при неаккуратной работе есть риск внести в пробу ингибиторы (например, тальк с перчаток).
Ошибки при интерпретации результата
Говоря об ошибках при интерпретации результатов, имеет смысл рассмотреть различные способы детекции.
При детекции с использованием гель-электрофореза есть риск принять неспецифические фрагменты за специфичные, если они близки по длине и нет возможности четко и однозначно сравнить с положительным контролем и, в идеале, с маркером длин.
В случае нарушений правил работы существует рискконтаминации уже на этапе детекции. Такого рода контаминация отслеживается в случае, если полоса наблюдается в заведомо отрицательной пробе, однако она неотличима от контаминации в лаборатории и требует повторной проверки всех образцов.
Одной из ошибок интерпретации, связанной с использованием метода флуоресцентной детекции по конечной точке, является невнимательное отношение к нормировочным значениям фоновых пробирок и к значениям флуоресценции в отрицательных пробах. Так, при неправильном хранении зонды в фоновых пробирках могут разрушаться, и нормировочные значения существенно увеличиваются (от нескольких часов до нескольких дней), при этом значения флуоресценции в образцах оказываются в большей или меньшей степени занижены. Главным критерием достоверности полученных результатов в данном случае могут служить отрицательные пробы. При отсутствии расхождений между фоновыми и амплификационными пробирками отрицательные образцы имеют значения флуоресценции близкие к единице или, в редких случаях, чуть выше. Если значения флуоресценции в одном или нескольких образцах или отрицательном контроле существенно ниже единицы, с большой долей вероятности можно утверждать, что фоновые пробирки не соответствуют данному исследованию, в этом случае необходимо их поменять.
Помимо вышеприведенного примера, может случиться так, что фоновая флуоресценция возрастает в амплификационных пробирках, в то время как в фоновых пробирках флуоресценция остается неизменной. Такая ситуация может возникнуть когда амплификационные пробирки хранятся при комнатной температуре. В этом случае будет увеличиваться содержание положительных результатов с низкими значениями флуоресценции. Результаты при этом получаются такие же, как при контаминации в лаборатории, однако в данном случае все низкие значения флуоресценции будут примерно одинаковы, что ц случае контаминации встречается достаточно редко, поскольку маловероятно, что во все отрицательные пробирки попадет равное количество постороннего материала. Подобного легко избежать, если менять фоновые пробирки раз в месяц-полтора, в этом случае, как правило, не успевает появиться достаточно большая разница между уже готовыми фоновыми и амплификационными пробирками.
Наиболее частая ошибка при исследовании методом ПЦР с де
текцией результатов в режиме реального времени связана с прибором, который при больших колебаниях флуоресценции может зафиксировать ложноположительные результаты.
В связи с этим необходимо проводить анализ индивидуальной кривой. Пороговая линия должна пересекать индивидуальную кривую и области начала экспоненциального роста, и это не один из множества пиков колебания флуоресценции. Также прибор может выдать ложноотрицателъный результат в случае, если на первых циклах ПЦР по каким-то причинам произошло существенное уменьшение флуоресценции. Эту ошибку можно обнаружить при анализе исходных кривых флуоресценции. Если образец положительный, то на исходной кривой будет виден четкий экспоненциальный рост. Для большей достоверности можно сравнить такую сомнительную кривую с кривой заведомо положительной. Все положительные кривые имеют сходный угол наклона, и уровень флуоресценции при выходе на плато заметь" но отличается от колебаний и отрицательных образцах.
3.Ошибки постаналитического этапа ПЦР-диагностики
Ошибки на завершающем, постаналитическом этапе связаны с неверной интерпретацией врачом результатов ПЦР-анализа вследствие ошибочных представлений об инфекционном агенте или о возможностях метода.
Например, контрольное исследование на хламидиоз через 1 неделю после окончания курса антибиотиков даст положительный результат. Врач сделает вывод о неэффективности проведенной терапии. Однако окончательный вывод можно сделать не ранее чем через 4-6 недель, после того, как сменится эпителиальный слой, в котором паразитирует данный микроорганизм. Более ранняя диагностика может показать неверный результат, поскольку в клетках эпителия еще сохраняются погибшие микроорганизмы.Важно учитывать специфичность используемых тест-систем. Так, например, пациент с предполагаемым диагнозом "респираторный хламидиоз" направляется на исследование. При постановке ПЦР используется видоспецифическая тест-система для выявления ДНК С. Trachomatis- результат исследования отрицательный. Однако врач не должен снимать предполагаемый диагноз, поскольку инфекция может быть вызвана другими видами хламидий, например С. рneumoniа, С. ресоrum, С. psitaci,которые не диагносцируются данной тест-системой. То есть при назначении ПЦР-исследования врач должен очень четко представлять границы специфичности применяемых тест-систем.
Вместе с тем несовпадение результатов различных методов исследования не говорит об ошибке. Зачастую ПЦР-исследование дает положительный результат, в то время как ИФА - отрицательный. Несовпадение результатов исследований может объясняться, например, периодом "серологического окна".
В случае обратных результатов исследований возможен "иммунологический след" - остаточный уровень антител, который у некоторых людей может сохраняться многие месяцы и даже годы после выздоровления, либо при проведении ПЦР не учитывается видоспецифичность тест-систем.
Приведенные примеры показывают, что для получения качественных результатов исследований необходимо четкое выполнение правил работы на всех этапах клинической лабораторной диагностики и тесная взаимосвязь специалистов ПЦР-лаборатории с врачами-клиницистами.
Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний
1.Прямое определение наличия возбудителей.
Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.
2.Высокая специфичность.
Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.
3.Высокая чувствительность.
Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-анализ обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток).
4.Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.
Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.
5.Высокая скорость получения результата анализа.
Для проведения ПЦР- анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-5 часов.