1.6.2 Протеин С
Физиологический антикоагулянт, в активированном состоянии инактивирует активные V, VII факторы, ингибирует активатор плазминогена (активность проявляется преимущественно в микроциркуляторном русле).
Активность протеина С кратковременно увеличивалась к 5-7 дню стимуляции, что связано с действием половых гормонов.
В нашем городе активность протеина С не определяется.
1.7 Осложнения
У определенного процента женщин в ходе реализации программы ЭКО и ПЭ возникает такое осложнение, как СГЯ (синдром гиперстимуляции яичников). По выраженности симптомов и уровню половых гормонов СГЯ подразделяют на легкую, среднюю и тяжелую формы. Распространенность умеренных и тяжелых форм СГЯ составляет от 1 до 10%. Тяжелые проявления сопровождаются кровотечением, асцитом, гидротораксом, нарушением баланса электролитов, печеночно-почечной недостаточностью, тромбоэмболией и поэтому рассматриваются, как один из основных рисков при реализации программы ЭКО и ПЭ.
Была выявлена прямая зависимость между тяжестью течения СГЯ и выраженностью изменений, свидетельствующих об активации во всех звеньях системы гемостаза.
У пациенток с риском развития СГЯ рекомендуется проводить исследования системы гемостаза несколько раз в период с момента переноса эмбрионов до дня первичной диагностической беременности с целью своевременного назначения противотромботической терапии и контроля за ее проведением.
2. Материалы и методы исследования
Для исследования системы гемостаза были обследованы 10 пациенток в возрасте 26 – 33 лет на всех основных этапах реализации программы ЭКО и ПЭ (стимуляция, день введения ХГ, день ПЭ, 14-й день после ПЭ). Показатели гемостаза исследовали в плазме крови.
Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз оценивали по количеству тромбоцитов. Для подсчета тромбоцитов использовали агрегометр АР 2110.
Для оценки изменений прокоагулянтной активности плазмы крови определяли ПВ, АПТВ, ТВ и концентрацию фибриногена на гемокоагулометре CGL 2110.
Антикоагулянтное звено гемостаза оценивали с помощью определения активности АТ III на гемокоагулометре CGL 2110.
Необходимо отметить, что на 14 день после переноса эмбрионов у пациенток проводили определение β-ХГ для выяснения вопроса о наступлении беременности (эффективности программы).
В ходе обследования десяти пациенток был получен следующий результат: у семи женщин наступила беременность (эффективный цикл); у трех женщин – отсутствие беременности (неэффективный цикл).
2.2 Методы исследования сосудисто – тромбоцитарного гемостаза
2.2.1 Определение количества тромбоцитов
Состав набора:адреналин; растворитель для адреналина, 8,5 мл – во флаконе.
Оборудование, материалы, реагенты:пипетки вместимостью 0,05 – 2,0 мл; физиологический (0,9%) раствор хлорида натрия.
Приготовление анализируемых образцов: венознуюкровь центрифугируют при 1000 об/мин (240 g) в течение 7 мин. Богатую тромбоцитами плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют при 3000 об/мин (1200g) в течение 15 мин., в результате получают бедную тромбоцитами плазму.
Разведение адреналина:во флакон с адреналином внести 8,0 мл растворителя для адреналина и развести содержимое при комнатной температуре путем встряхивания в течение 10 мин. В результате получают маточный раствор адреналина (500 мкг/мл).
Для приготовления рабочего раствора адреналина из маточного пользуются следующей схемой:
| Номер раствора с адреналином | Физиологический(0,9%)раствор хлорида натрия | Разведение маточного раствора | Конечная концентрация при агрегометрии (0,45 мл плазмы + 0,05 мл раствора адреналина) |
| 1 | 4,9 мл + 0,1 мл маточн. раствора | 1:50 | 10 мкг/мл |
| 2 | 1,0 мл + 1,0 мл из раствора 1 | 1:100 | 5 мкг/мл |
| 3 | 1,0 мл + 1,0 мл из раствора 2 | 1:200 | 2,5 мкг/мл |
Запись агретограммпроводят в соответствии с инструкцией к агрегометру. С помощью растворов адреналина разной концентрации получают запись кривых агрегации тромбоцитов. Наряду с кривыми агрегации на экране отображается количество тромбоцитов в исследуемой плазме. В норме количество тромбоцитов составляет 140 – 400*109/л
2.3 Методы исследования коагуляционного гемостаза
2.3.1 Определение протромбинового времени (Техпластин – тест)
Принцип метода:тромбопластин (фактор III, тромбокиназа) превращает протромбин плазмы крови в присутствии ионов кальция в активный фермент тромбин, трансформирующий фибриноген плазмы крови в нерастворимый фибрин. Измеряется протромбиновое время – время образования фибрина в плазме крови в присутствии ионов кальция и тканевого тромбопластина (растворимого экстракта из мозга человека).
Состав набора:техпластин – лиофильно высушенная тромбопластин-кальциевая смесь, на 5,0 мл суспензии – 4 фл. МИЧ Техпластина в разных сериях составляет 1.1 или 1.2.; контрольная плазма – лиофильно высушенный пул плазмы крови не менее, чем от 20 здоровых людей, на 0,5 мл – 1фл.
Оборудование, материалы, реагенты:коагулометр; пипетки вместимостью 0,1; 0,2; 0,5; 5,0 мл; вода дистиллированная.
Приготовление анализируемых образцов:венозную кровь центрифугируют при 3000 – 4000 об/мин (1200 g) в течение 15 мин. Получают бедную тромбоцитами плазму.
Подготовка реагентов к работе:
Разведение Техпластина: в один флакон с Техпластином внести 5,0 мл дистиллированной воды. Флакон встряхнуть и выдержать при +370С в течение 20 мин.
Разведение контрольной плазмы: во флакон с контрольной плазмой внести 0,5 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре и легком покачивании в течение 3 мин. Разведенную плазму перед исследованием выдержать 25-30 мин. при комнатной температуре.
Проведение анализа:
Определение контрольных (нормальных) показателей:
1. В кювету коагулометра внести 0,1 мл контрольной плазмы.
2. Инкубировать при температуре + 370С 1 мин.
3. Добавить 0,2 мл разведенного Техпластина, имеющего температуру +370С и начать отсчет времени свертывания до образования фибрина.
Аналогично определить протромбиновое время в образцах плазмы больных.
В норме протромбиновое время, измеренное на коагулометре, составляет 12-15 с.
Рассчитывают протромбиновый индекс по следующей формуле:
В норме ПТИ составляет 85 – 105%.
2.3.2 Методы определения АЧТВ ((АПТВ/АЧТВ) – тест)
Принцип метода:определяется время свертывания плазмы крови в условиях стандартизированной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефалином) активации процесса в присутствии ионов кальция.
Состав набора:кефалин (лиофильно высушенный фосфолипидный компонент) – 2 фл.; каолин (концентрированная суспензия 200:1 в дистиллированной воде), 1 мл – 1 фл.; буфер трис НСl (концентрированный 20:1 раствор, 1 М), 10 мл – 1 фл.; кальция хлорид (концентрированный 20:1 раствор, 5 М), 10 мл – 1 фл.
Оборудование, материалы, реагенты:коагулометр; пипетки вместимостью 0,1; 5,0 мл; вода дистиллированная; цилиндр мерный вместимостью 200 мл.
Приготовление анализируемых образцов:венознуюкровь центрифугируют при 1000 об/мин (240 g) в течение 7 мин. Богатую тромбоцитами плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют при 3000 об/мин (1200g) в течение 15 мин., в результате получают бедную тромбоцитами плазму.
Подготовка реагентов к работе:
Разведение кефалина: в один флакон с кефалином внести 2,0 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре и энергичном покачивании в течение 2 мин. В результате получают раствор кефалина, который до использования должен быть выдержан при комнатной температуре в течение 60 мин.
Приготовление АПТВ – реагента: концентрированный буфер трис НСl и концентрированную суспензию каолина количественно перенести из флаконов в мерный цилиндр и общий объем довести дистиллированной водой до 200 мл. В результате получают рабочую суспензию каолина. Для приготовления AЧТВ - реагента смешать в пробирке 0,1 мл раствора кефалина с 3,0 мл рабочей суспензии каолина.
Приготовление рабочего раствора хлорида кальция: в день исследования, в соответствии с потребностью, концентрированный раствор хлорида кальция развести дистиллированной водой в 20 раз (1 объем концентрированного раствора + 19 объемов воды).
Проведение анализа:
1. В кювету коагулометра внести 0,1 мл исследуемой плазмы и прогреть ее при +370С в течение 1 мин.
2. В кювету добавить 0,1 мл AЧТВ - peaгeнтa, имеющего комнатную температуру.
3. Через 3 мин к смеси добавить 0,1 мл рабочего раствора хлорида кальция и зарегистрировать время свертывания.
AЧТВ в нормальной плазме составляет 28-38 с.
2.3.3 Определение тромбинового времени (Тромбо – тест)
Принцип метода:заключается в определении времени свертывания плазмы крови под влиянием тромбина стандартной активности.
Состав набора: тромбин (лиофильно высушенный, 6-8 ед NIH во фл.) - 4 фл.; контрольная плазма (лиофильно высушенная) - 1 фл.
Оборудование, материалы, реагенты:коагулометр; пипетки вместимостью 0,1 - 1,0, 10,0 мл; вода дистиллированная;
Приготовление анализируемых образцов:венозную кровь центрифугируют при 3000 – 4000 об/мин (1200 g) в течение 15 мин. получают бедную тромбоцитами плазму.
Подготовка реагентов к работе:
Разведение тромбина: в один из флаконов с тромбином внести необходимое количество дистиллированной воды (см. таблицу) и растворить содержимое при комнатной температуре и легком покачивании в течение 2-3 мин.
Ориентировочные значения нормы тромбинового времени свертывания
| Объем дистиллированной воды на флакон с тромбином, мл | Время свертывания, сек.,при коагулометрическомопределении |
| 2,0 | 11-14 |
| 3,0 | 15-19 |
| 5,0 | 20-29 |
Разведение контрольной плазмы:во флакон с контрольной плазмой внести 0,5 млдистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре и легком покачивании в течение 3 мин.