Исследование системы гемостаза при экстракорпоральном оплодотворении (стр. 5 из 5)
Проведение анализа:
1. В кювету коагулометра внести 0,1 мл контрольной плазмы и прогреть ее при +370С в течение 1 мин.
2. В ту же кювету добавить 0,1 мл раствора тромбина и зарегистрировать время свертывания.
Исследование плазмы больного выполняется аналогично.
Чтение результатов:результат выражают в секундах, сравнивают время свертывания контрольной и исследуемой плазмы. В норме ТВ составляет 14 – 17 с.
2.3.4 Определения концентрации фибриногена (Квик – Фг – тест)
Принцип метода:образовавшийся после свёртывания плазмы крови фибрин быстро высушивается и по его весу определяется содержание фибриногена в плазме.
Состав набора:тромбопластин, 1 г – 2 фл.; хлорид кальция (концентрированный 20:1 раствор, 5,54%), 10 мл – 6 фл.; буфер трис – НСl (концентрированный 20:1 раствор, 1 М), 10 мл – 2 фл.
Оборудование, материалы, реагенты: термобаня на 370; весы торсионные; центрифуга лабораторная; пробирки стеклянные; цилиндр мерный вместимостью 200 мл; ступка фарфоровая с пестиком; вода дистиллированная; бумага фильтровальная.
Приготовление анализируемых образцов: кровь центрифугируют при 3000 – 4000 об/мин (1200g) в течение 15 мин. Получают бедную тромбоцитами плазму.
Приготовление реагентов:
Приготовление суспензии тромбопластина: навеску сухого тромбопластина (50 мг) поместить в фарфоровую ступку, добавить 1,0 мл физиологического (0,9 %) раствора хлорида натрия или раствора трис – буфера (0,05 М, pH 7,4) и тщательно растирать в течение 2 мин. Затем дополнительно добавить в ступку 4,0 мл выбранного раствора, перемешать с помощью пестика и взвесь центрифугировать при 1000 об/мин (240 g) в течение 5-6 мин. Надосадочную жидкость слить в другую пробирку и использовать для анализа.
Разведение концентрированного буфера: содержимое одного флакона с концентрированным буфером трис – НСl перенести в мерный цилиндр и довести объем дистиллированной водой до 200 мл. Получаем рабочий раствор буфера.
Проведение анализа:
1. В пробирке последовательно смешать 1,0 мл исследуемой бедной тромбоцитами плазмы крови, 0,1 мл суспензии тромбопластина и 0,1 мл 5, 54 % раствора хлорида кальция.
2. Пробирку встряхнуть и поместить на водяную баню при +37оС на 10 мин.
3. Образовавшийся в результате инкубации сгусток перенести на фильтровальную бумагу и высушивают путём сжатия и перемещения сгустка по фильтру.
4. Сгусток фибрина выдержать на открытом воздухе при комнатной температуре в течение 15 – 20 мин и взвесить на торсионных весах.
В норме масса сгустка, полученного из 1 мл плазмы крови, составляет 10 – 20 мг. Содержание фибриногена в г/л находят при умножении массы сухого фибрина на коэффициент 0,2. В норме содержание фибриногена в плазме составляет 2,0 – 4,0 г/л.
2.4 Методы исследования антикоагулянтного гемостаза
2.4.1 Определение активности антитромбина III
Принцип метода:исследуемую плазму обрабатывают сорбентом гепарина, подвергают тепловой дефибрикации и смешивают со стандартным количеством тромбина. После инкубации смеси в ней определяют остаточную коагуляционную активность тромбина. По уровню снижения активности тромбина оценивают активность АТ III в исследуемой плазме.
Оборудование и материалы: коагулометр; набор реагентов для определения активности антитромбина III ООО Технология – Стандарт.
Проведение анализа:в пробирку вносят 0,4 мл раствора тромбина и прогревают на водяной бане (37оС) в течение 2 мин. Параллельно в кювету коагулометра вводят 0,15 мл разведённой плазмы (или раствора фибриногена) и инкубируют при t 37оС не менее 1 мин.
К раствору тромбина в пробирку добавляют 0,1 мл исследуемой адсорбированной и дефибринированной плазмы, включают секундомер. Через 2 минуты (точно!) инкубируют при той же температуре 0,1 мл смеси, вносят в кювету коагулометра, содержащую разведённую контрольную плазму и начинают отсчёт времени свёртывания. По калибровочной кривой, построенной с применением коагулометра, определяют активность АТ III в процентах. В норме активность АТ III составляет 80 – 120%.
3. Результаты и их обсуждение
3.1 Исследование сосудисто–тромбоцитарного гемостаза
Результаты исследования сосудисто – тромбоцитарного гемостаза представлены на рис. 1.
Общее количество тромбоцитов не менялось на протяжении всей стимуляции, достоверно увеличиваясь только к 14 дню после переноса эмбрионов.
Рис. 1. Количество тромбоцитов в эффективных и неэффективных циклах. Здесь и на рис. 2-6 1- стимуляция суперовуляции, 2- день введения хорионического гонадотропина, 3- день переноса эмбриона в полость матки, 4- 14–ый день после переноса эмбриона. Достоверность отличий:
3.2 Исследование коагуляционного гемостаза
Результаты исследования коагуляционного гемостаза представлены на рис. 2-5.
Концентрация фибриногена постепенно возрастала, начиная с 5-7 дня стимуляции до дня ПЭ, и сохранялась на уровне в 1,4 раза превосходящем исходный до 14 дня после ПЭ.
Рис. 2. Протромбиновый индекс в эффективных и неэффективных циклах.
Также, начиная с 5-7 дня стимуляции, было отмечено достоверное укорочение тромбинового времени. Увеличение протромбинового индекса и укорочение АЧТВ, свидетельствующие о повышении активности факторов внешнего и внутреннего пути свертывания, происходило только к 14 дню. Можно предположить, что полученные изменения являются результатом длительного воздействия высоких концентраций половых гормонов.
Рис. 3. АЧТВ в эффективных и неэффективных циклах.
Рис 4. Тромбиновое время в эффективных и неэффективных циклах.
Рис. 5. Концентрация фибриногена в эффективных и неэффективных циклах.
Таким образом, в результате проведения стимуляции суперовуляции происходит усиление коагуляционного потенциала крови за счет увеличения концентрации основного субстрата свертывания крови – фибриногена и повышения суммарной активности факторов, составляющих как внешний, так и внутренний путь активации гемостаза.
3.2 Исследование антикоагулянтного звена гемостаза
Результаты исследования антикоагуляционного гемостаза представлены на рис. 6.
АТ III практически не изменялся на всем протяжении исследования. Отмечалось лишь достоверное снижение активности АТ III (на 5,1%) ко дню введения овуляторной дозы ХГ (пик стимуляции и уровня эстрадиола).
Рис. 6. АТ III в эффективных и неэффективных циклах.
На фоне наступившей беременности и высокого уровня половых гормонов поддерживаются более значимые изменения гемостазиологических показателей, что может неблагоприятно влиять на развивающуюся беременность. При увеличении коагулятивной активности крови можно наблюдать нарушение (снижение) кровотока в матке, что затрудняет нормальное развитие эмбриона. По-видимому, у пациенток с наступившей беременностью в циклах ЭКО и ПЭ на 14 день после переноса эмбрионов развивается состояние, потенциально опасное для развития тромботических осложнений и ДВС-синдрома. Тем не менее, и в случае отсутствия беременности при ЭКО и ПЭ большинство параметров значительно отличались от исходного уровня.
Выводы
В результате исследования были отмечены следующие изменения в системе гемостаза:
1. Усиление прокоагулянтных свойств сосудистого эндотелия,
2. Наиболее выраженные изменения претерпевают такие лабораторные параметры гемостаза, как:
а. повышение уровня фибриногена,
б. укорочение тромбинового времени.
3. У данных больных развитие беременности сопряжено с повышенным риском.