Клинико-диагностическое значение пигментного обмена (стр. 1 из 6)
Пигментный обмен
Под пигментным обменом подразумевают обычно все процессы образования, превращения и распада пигмента крови (гемоглобина), точнее его пигментной небелковой части, и главного деривата этого пигмента— желчного пигмента (билирубина). В настоящее время однако известны и другие пигменты, которые по хим. составу по – видимому, близки НЬ — это-НЬ мышц, цитохромы, дыхательный фермент Варбурга (Warburg) и другие еще весьма мало изученные пигменты. Отделить процессы образования, превращения и распада этих пигментов от процессов обмена НЬ пока невозможно. В более широком смысле под П..о. можно подразумевать процессы образования, превращения и распада всех пигментов организма, т. е. как вышеперечисленных пигментов, группы НЬ, так и всех других пигментов— меланина, липохромов и т. д.
ФИЗИОЛОГИЯ ОБМЕНА БИЛИРУБИНА
Процесс превращения свободного (непрямого) билирубина, образующегося при разрушении эритроцитов и распаде гемоглобина в органах ретикулоэндотелиальной системы (РЭС), в билирубин-диглюкуронид (связанный, или прямой билирубин) в печеночной клетке (рис. 1) осуществляется в три этапа (на рисунке обозначены римскими цифрами):
Рис. 1. Процессы обезвреживания свободного (непрямого) билирубина и мезобилиногена (уробилиногена) в печеночной клетке.
Бн - свободный (непрямой) билирубин; Б-Г - билирубин-глюкуронид (связанный, или прямой билирубин); Мбг - мезобилиноген (уробилиноген).
Римскими цифрами обозначены этапы обезвреживания
1. I этап — захват билирубина (Б) печеночной клеткой после отщепления альбумина;
2. II этап — образование водорастворимого комплекса билирубин-диглюкуронида (Б-Г);
3. III этап — выделение образовавшегося связанного (прямого) билирубина (Б-Г) из печеночной клетки в желчные канальцы (проточки).
Дальнейший метаболизм билирубина связан с поступлением его в желчные пути и кишечник. В нижних отделах желчевыводящих путей и кишечнике под воздействием микробной флоры происходит постепенное восстановление связанного билирубина до уробилиногена. Часть уробилиногена (мезобилиноген) всасывается в кишечнике и по системе воротной вены вновь попадает в печень, где в норме происходит практически полное его разрушение (см. рис. 1). Другая часть уробилиногена (стеркобилиноген) всасывается в кровь в геморроидальных венах, попадая в общий кровоток и выделяясь почками с мочой в незначительных количествах в виде уробилина, который часто не выявляется клиническими лабораторными методами. Наконец, третья часть уробилиногена превращается в стеркобилин и выделяется с калом, обусловливая его характерную темно-коричневую окраску.
Методы определения билирубина и его метаболитов
Определение билирубина в сыворотке крови
В клинической практике используются различные методы определения билирубина и его фракций в сыворотке крови.
Наиболее распространенным из них является биохимический метод Ендрассика-Грофа. Он основан на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. При этом связанный билирубин (билирубин-глюкуронид) дает быструю («прямую») реакцию с диазореактивом, тогда как реакция свободного (не связанного с глюкуронидом) билирубина протекает значтельно медленнее. Для ее ускорения применяют различные вещества–акселераторы, например кофеин (метод Ендрассика-Клеггорна-Грофа), которые освобождают билирубин из белковых комплексов («непрямая» реакция). В результате взаимодействия с диазотированной сульфаниловой кислотой билирубин образует окрашенные соединения. Измерения проводят на фотометре.
ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В 3 пробирки (2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы, как указано в таблице. Диазореакция
| Ингридиенты | Опытная проба мл | Холостая проба мл | |
| Общий билирубин | Связанный билирубин | ||
| Сыворотка | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Кофеиновый реактив | 1,75 | - | 1,75 |
| Раствор хлорида натрия | - | 1,75 | 0,25 |
| Диазосмесь | 0,25 | 0,25 | - |
Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять 20 мин, после чего измеряют на фотометре. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется. Измерение проводят при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы. Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина.Метод Ендрассика, Клеггорна и Грофа прост, удобен в практике, не связан с применением дефицитных реактивов и является наиболее приемлемым для практических лабораторий.Определение рекомендуется приводить сразу же после забора проб, чтобы избежать окисления билирубина на свету. Гемолиз сыворотки снижает количество билирубина пропорционально присутствию гемоглобина. Следовательно, сыворотка крови не должна быть гемолизирована.
Ряд веществ — гидрокортизон, андрогены, эритромицин, глюкокортикоиды, фенобарбитал, аскорбиновая кислота — вызывают интерференцию.
Постоение калибровочного графика при методе ендрассика.
Способ I — Шелонга-Вендес использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови. Основной раствор билирубина: в колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30—35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na2CO3. Хорошо взбалтывают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором Nа2СО3 и несколько раз перемешивают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем происходит окисление билирубина. Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл свежеприготовленного основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней. Этот раствор содержит точно на 100 мг/л, или 171 мкмоль/л, билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении на фотометре из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости. Для приготовления компенсационной жидкости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина. К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 мин. Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным (как указано ниже), и далее обрабатывают их так же, как калибровочные пробы.
Таблица. Определение связанного билирубина
| № пробирки | Рабочий раствор билирубина мл | Изотонический раствор NaCl, мл | Количество билирубина в пробе | Концентрация билирубина в сыворотке крови, мкмоль/л | |
| мг | мкмоль | ||||
| 1 | 0,05 | 0,45 | 0,005 | 0,00855 | 17,1 |
| 2 | 0,1 | 0,4 | 0,01 | 0,0171 | 34,2 |
| 3 | 0,15 | 0,35 | 0,015 | 0,02565 | 51,3 |
| 4 | 0,2 | 0,3 | 0,02 | 0,0342 | 68,4 |
| 5 | 0,25 | 0,25 | 0,025 | 0,04275 | 85,5 |
· Способ второй – выстраивать калибровочный график по готовому набору реактивов.(Например, набор Билирубин –эталон фирмы Лахема, включающий в себя билирубин лиофилизированный (точная концентрация билирубина приведена на этикетке флакона); и альбумин лиофилизированный.)
Определение билирубина в сыворотке крови прямым фотометрическим методом
Определение общего билирубина прямым фотометрическим методом чрезвычайно просто, удобно, не требует венепункции (исследуется капиллярная кровь), может повторяться неоднократно в течение суток. Недостатком метода является невозможность определить фракции билирубина, меньшая точность при выраженном гемолизе.
Несмотря на то, что при этом определяется только общий билирубин, этот подход представляет значительный интерес в неонатологии, так как у новорожденных детей преобладает одна производная билирубина, практически равная концентрации общего билирубина. Билирубин представляет собой пигмент с ярко выраженной желтой окраской. Его спектральная кривая поглощения имеет максимум на длине волны 460 нм (синяя область спектра). Измеряя поглощение на этой длине волны можно было бы определить концентрацию общего билирубина в крови. Однако ряд факторов усложняют такое измерение. Билирубин является сильным поглотителем и поэтому оптимальная для построения фотометра плотность 0,3-0,5 Б оптической плотности достигается в кювете с длиной оптического пути примерно 250 микрометров (0,25 мм).
Изготовить такую кювету непросто. Кроме того, фотометрирование непосредственно крови усложняется присутствием форменных элементов крови, рассеянием света на них, а также интерференцией билирубина с гемоглобином, который частично поглощает свет в синей области спектра. Поэтому для фотометрирования необходимо, во-первых, получить образцы плазмы крови, а, во-вторых, нужно исключить влияние гемоглобина, присутствующего в небольшом количестве в плазме. Плазму для фотометрирования получают на лабораторных центрифугах в гепаринизированных гематокритных капиллярах.