Параметры функционирования митоКАТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию (стр. 3 из 13)
Результаты исследования электрофизиологических свойств нативных КАТФ каналов позволяют предположить, что они принадлежат к классу калиевых каналов внутреннего выпрямления (KIR). В 1993 году на многие KIR каналы (KIR1.1 [Hoetal., 1993], KIR2.1 [Kuboetal., 1993], KIR3.1 [Dascaletal.,1993]) были получены клоны. Их выделили в отдельное подсемейство KIR-каналов (KIR1.0-6.0), основанное на унифицированной номенклатуре [ChandyandGutman, 1993]. Гидрофобные участки клонированных KIR каналов содержат два мембранопересекающих сегмента М1 и М2, образующих пору. Подобно потенциалзависимым К+ каналам, KIR каналы, вероятно, формируют тетрамер [Doupniketal., 1995; SalkoffandJegla, 1995; Nicholsetal., 1996; NicholsandLopatin, 1997].
Также был клоирован регуляторный белок, содержащий участок, связывающий сульфонилочевину (SU-связывающий сайт) [Aguillar-Bryanetal., 1995; Thomasetal., 1995; Inagakietal., 1996; Isomotoetal., 1996]. Клонированные регуляторные белки получили название SUR. SUR содержит два нуклеотидсвязывающих участка (NFBs) с цитоплазматической стороны. N-конец находится с внешней стороны мембраны и содержит два домена, предположительно из 9 и 4 пронизывающих мембрану спиралей (Рис.2) [Yokoshikietal., 1998].
Рис. 2. Схематическое изображение цитоплазматического КАТФ канала как комплекса KIR и SUR [YokoshikiH. etal., 1998]
Считается, что нативный КАТФ канал представляет собой комплекс из четырех KIR6.x и четырех SUR субъединиц [Clementetal., 1997]. Различные типы регуляторных субъединиц, SUR1, SUR2A и SUR2B, обнаружены, соответственно, в поджелудочной железе, сердце и гладких мышцах [Ammalaetal., 1996; Inagakietal., 1996; Yamadaetal., 1997].
1.3 АТФ-чувствительный калиевый канал внутренней мембраны МХ
В 1981 г. из внутренней мембраны МХ был выделен К+-селективный канал (митоКАТФ) [Миронова и др., 1981], который ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Pauceketal., 1992; Миронова и др., 1996 (I)]. В 1991 г. этот канал был впервые обнаружен во внутренней мембране МХ методом пэтч-кламп [Inoueetal., 1991], позднее появились аналогичные работы других исследователей [Nakaeetal., 2003; Fikretetal., 2004; Dahlemetal., 2004; Bednarczyketal., 2005]. В настоящее время канал активно изучается, поскольку обнаружено, что он участвует в адаптации организма к гипоксии [Garlidetal., 1997]. В настоящее время основными методами выделения АТФ-ингибируемого МХ калиевого канала (митоКАТФ) является метод водно-этанольной экстракции [Миронова и др., 1981; Миронова и др., 1996 (I)] и солюбилизация белка-канала из мембраны Тритоном Х-100 с последующей очисткой ионообменной хроматографией. При этом митоКАТФ канал выделяют в виде белка с молекулярной массой 55 кДа [Mironovaetal., 2004].
1.3.1 Структурная организация митоКАТФ канала
Так как митоКАТФ имеет ряд общих свойств с цитоКАТФ и регулируется общими регуляторами, было предположено, что по структуре он близок к цитоплазматическому каналу [Mironova et al., 1999] и состоит из канальной субъединицы [Mironova et al., 2004] и регуляторной [Bajgar et al., 2001]. Белок с м. м. 55 кДа, выделенный из внутренней мембраны МХ печени крысы, является, по-видимому, канальной субъединицей митоКАТФ. При встраивании в БЛМ этот белок формирует АТФ-зависимые каналы (митоKIR). Активность этих каналов не блокируется глибенкламидом и специфическим ингибитором митоКАТФ 5-ГД, и не активируется кромакалимом и ддиазоксидом. Однако эти препараты влияют на АТФ-зависимый калиевый транспорт в изолированных МХ, где есть обе субъединицы канала [Mironova et al., 2004].
МитоКАТФ, также как и клеточный, является, по всей вероятности, гетеромультимером, состоящим из калиевого канала, белка с молекулярной масой 55 кДа, который имеет выпрямляющие свойства и который, по аналогии с цитоплазматическим каналом, был назван митоKIR (от англ. Inward rectifying) [Mironova et al., 2004] и рецептора, чувствительного к сульфонилмочевинам и поэтому названного митоSUR (от англ. sulphonylurea) (Рис. 3) [Mironova et al., 1999; Bajgar et al., 2001].
Кi для АТФ на реконструированном в БЛМ митоKIR выше, чем в интактных МХ и Mg2+ для этого ингибирования не требуется. Тогда как для АТФ-ингибирования канала, локализованного в интактных МХ, присутствие магния было необходимо [Mironova et al., 2004]. Те же различия были обнаружены при сравнительном изучении влияния АТФ и сульфонилмочевин на цитоKIR и целый цитоКАТФ [Tucker et al., 1997]. Известно, что основной участок связывания АТФ в цитоКАТФ локализован на канальной субъединице. Регуляторная субъединица повышает сродство канальной субъединицы к АТФ и обеспечивает чувствительность целого канала к активаторам и ингибиторам [Tucker et al., 1997].
Рис.3. Рабочая модель структуры МХ АТФ-зависимого К+ канала [Mironova et al., 2004]
Приведенные выше результаты исследований митоКАТФ подтверждают предположение о том, что белок с м.м. 55 кДа является канальной субъединицей целого митоКАТФ. Функцию регуляторной субъединицы выполняет, вероятно, белок с м.м. 63 кДа, связывающийся с меченым глибенкламидом [Bajgar et al., 2001].
В то же время, результаты исследований, проведенных на МХ сердца, с использованием антител на Kir6.1 и Kir6.2, а также на SUR1 и SUR2, показали, что в МХ кардиомиоцитов присутствуют Kir6.1 и Kir6.2, но нет ни SUR1, ни SUR2. Однако в них обнаруживается SUR2-подобный белок, который, возможно, является сплайсированным вариантом SUR2 [Lacza et al., 2003 (I)].
При исследовании митоКАТФ мозга, близкого по структуре к цитоКАТФ [Lacza et al., 2003 (II)], с использованием АТ к KIR6.1 и KIR6.2, а также SUR1 и SUR2 субъединицам цитоКАТФ было показано, что очищенные МХ мозга содержат преимущественно KIR6.1 и, в меньшей степени, KIR6.2 и не содержат SUR1 и SUR2. Согласно выводам авторов, в формировании митоКАТФ мозга участвует укороченный вариант SUR2 или белок, подобный по структуре SUR2. Кроме того, показано, что МХ мозга содержат в 8 раз больше KIR6.1 и SUR2-подобного белка, по сравнению с общим белком ткани мозга, что подтверждает локализацию этих белков в МХ [Lacza et al., 2003 (II)]. Тот факт, что м.м. митоKIR мозга несколько ниже (50 кДа), чем у митоKIR печени [Mironova et al., 1999; 2004], предполагает наличие тканевой специфичности в структуре каналов.
Было показано, что при встраивании в липосомы или липидные бислойные мембраны комплекса митохондриальных белков, состоящего из АТФ связывающего кассетного белка-1 (mАВС1 от англ. Mitochondrialbindingcasset), АТФ-азы, сукцинатдегидрогеназы, аденилаттранслоказы и фосфатного переносчика, в мембране образуются чувствительные к АТФ и глибенкламиду каналы [Ardehali etal., 2004]. Это послужило основой для другого варианта модели субъединичной организации митоКАТФ [Ardehali and O'Rourke, 2005]. Однако нельзя исключить наличие в этом белковом комплексе других митохондриальных белков, включая митоKIR, тем более что белок с м.м. 55 кДа в нём присутствует. Поcкольку этот мультикомплекс в липосомах индуцировал открытие неспецифической Са2+-зависимой поры в присутствие ионов Са2+ [Ardehali etal., 2004], это говорит о возможном загрязнении исследуемого комплекса порином и другими белками. Было показано, что один из белков этого комплекса, а именно mАВС1, играет важную роль в защите клеток миокарда от окислительного стресса [Ardehalietal., 2005]. Однако кардиопротекторное действие этого белка не снималось ингибиторами митоКАТФ - глибенкламидом и 5-НD. Поэтому, по мнению авторов, пока не получено достаточно доказательств для утверждения того, что mАВС1, имеющий, также как и митоКIR, м.м. 55 кДа, является частью митоКАТФ.
Таким образом, вопрос структуры митоКАТФ по-прежнему остается открытым. В связи с чем, в представленной работе была предпринята попытка определить относится ли белок с м.м. 55 кДа, выделяемый из внутренней мембраны МХ методом водно-этанольной экстракции, к системе АТФ-зависимого транспорта К+. Также, был проведен анализ гомологии структуры исследуемого белка последовательностям известных белков.
Глава 2. Модуляторы
2.1 Модуляторы митоКАТФ канала
2.1.1 Метаболические модуляторы митоКАТФ канала
В связи с выраженным кардиопротекторным действием активаторов митоКАТФ в настоящее время во многих лабораториях ведется поиск новых синтетических активаторов канала, которые могут быть потенциальными кардиопротекторами [Ockailietal., 2002; Kopustinskeneetal., 2001]. В нашей лаборатории помимо синтетического донора электронов ДЕБ, который селективно активировал митоКАТФ [Mironovaetal., 1999; Mironovaetal., 2004], был обнаружен ряд природных, то есть метаболических активаторов этого канала.
Дифосфонуклеотиды
Показано, что дифосфонуклеотиды (АДФ и ГДФ) активируют реконструированную в БЛМ канальную субъединицу (Рис. 2) [Grigorievetal., 1999; Mironovaetal., 1999]. Данные по активирующему действию ГДФ в дальнейшем были подтверждены и другими исследователями [Bednarczyketal., 2005]. Недавно в нашей лаборатории было показано, что в ряду дифосфонуклеотидов наиболее эффективным является уридиндифосфат (УДФ) [Mironovaetal., 2004].
В МХ УДФ (~20 мкМ) активирует митоКАТФ, и эта активация снимается глибенкламидом и 5-ГД (Рис. 4) [Mironovaetal., 2004]. Концентрации УДФ, неоходимые для активации реконструированного в БЛМ митоKIR и целого канала в нативных МХ, одинаковы. Следовательно, участок связывания УДФ локализуется на канальной субъединице. Для активации цитоКАТФ нужны значительно большие концентрации этого препарата [Alekseevetal., 1998].