Учитывая все вышесказанное можно сделать вывод, что механизм антиишемического действия активаторов митоКАТФ до сих пор окончательно не выяснен. Кроме того, остается непонятной причина сохранения устойчивости миокарда к гипоксии в течение длительного времени после ишемической адаптации сердца. Именно этот феномен может лежать в основе гипобарической адаптации животных и человека к гипоксии и связан он, вероятно, с экспрессией ряда белков, в том числе и белков, формирующих митоКАТФ [Kuzuya et al., 1993; Marber et al, 1993].
Известно, что синтетические активаторы митоКАТФ оказывают кардиопротекторный эффект. Обнаруженный в нашей лаборатории природный активатор митоКАТФ (УДФ) обладает по сравнению с ними рядом преимуществ, поскольку он не обладает побочными эффектами, которые могут наблюдаться при использовании синтетических препаратов и его концентрацию в клетке легко регулировать. В связи с этим, в работе исследовались анти-ишемическое и антиаритмическое действие уридина и УМФ (предшественников УДФ в клетке [Matsushita et al., 1970]) и опосредованы ли эти эффекты препаратов активацией митоКАТФ.
2.2.3 Феномен прерывистой гипобарической тренировки
В любой популяции неинбредных животных существуют особи с различной резистентностью к гипоксии [Березовский, 1978]. Индивидуальные различия в чувствительности к гипоксии и ее переносимости определяются при подъеме животных в барокамере на критическую высоту. Время жизни крайних типов животных (высоко- и низкоустойчивых к гипоксии) на критической высоте различается в 5 и более раз [Березовский, 1978; Чернобаева, Лукьянова, 1989]. Индивидуальные особенности реакции организма на гипоксию играют существенную роль в развитиии, течении и исходе возникающего при этом патологического состояния [Лукьянова и др., 1999; Лукьянова, Коробков, 1981].
Еще в 60-х годах прошлого века было замечено, что в популяциях, живущие на возвышенностях, частота возникновения инфаркта миокарда и смертности от сердечных заболеваний существенно ниже [Hurtado, 1960; Mortimer et al., 1977]. В 1966 г. Поупа с соавторами показали наличие кардиопротекторного эффекта гипобарической гипоксии у крыс с инфарктом миокарда, индуцированным протеренолом [Poupa et al., 1966]. В 1973 Меерсон с соавторами сообщили о том, что симуляция большой высоты 5 минут в день 5 дней в неделю, на 84% сокращает смертность крыс с лигацией коронарной артерии и на 35% размер инфаркта миокарда [Meerson et al., 1973]. Позднее блыло показано, что у крыс, подвергавшихся прерывистой гипоксии, уменьшались желудочковые аритмии, индуцированные ишемией/реперфузией, и лучше сохранялась сократительная функция желудочка [Meerson et al., 1987]. У крыс разных возрастов также увеличивалась устойчивость к аноксии после гипоксической тренировки [McGrath et al., 1973]. В дальнейшем в ряде исследований было показано, у животных, подвергавшихся нескольким предварительным циклам гипоксии, даже в нормобарических условиях, почти на 50% сокращается размер области инфаркта миокарда, вызванного лигированием коронарной артерии [Xi et al., 2002; Cai et al.,2003]. В 2004 Zong с соавторами показали эффективность прерывистой гипоксической тренировки в отношении снижения инфаркта миокарда и аритмии желудочка у собак [Zong et al., 2004]. Это нашло подтверждение и в последующих работах [Downey, 2006].
Интерес исследователей к гипоксической тренировке (ГТ) вызван тем, что она позволяет усилить эффект натренированности, ускоряет акклиматизацию к высоте, предотвращает и лечит некоторые заболевания [Roach., 2001; Levine.,2002; Powell and Garcia., 2000; Boning., 1997; Tin’kov and Aksenov., 2002]. Существуют два типа ГТ: гипобарическая и нормобарическая. В последнем случае животных помещают в камеру, в которую подвется воздух с вдвое сниженной концентрацией кислорода. ГТ включает в себя ~5 минутные эпизоды такой умеренной гипоксии с последующей нормоксией несколько раз в день в течение нескольких недель. Эта процедура не требует сложных приспособлений, а потому может использоваться в клинике [Zong et al., 2004]. Следует подчеркнуть, что Россия является пионеромв этих клинических исследованиях.
Кардиопротекторный эффект ГТ аналогичен открытому позднее действию прекондиции [Murry et al., 1983]. Это подтверждается результатами недавних экспериментов, согласно которым, из 46 пациентов с сердчно-сосудистыми заболеваниями, в течение 10 месяцев подвергавшихся ГТ, у 37 инфаркт миокарда не развился [Tin’kov and Aksenov, 2002]. ГТ нормализует и другие патологические состояния [Roach., 2001; Levine.,2002].
Однако, механизм ГТ до сих пор неясен. Колар предложил ряд возможных механизмов для объяснения ее кардиопротекторного действия. 1) Повышенная васкуляризация миокарда и коронарного кровотока, 2) увеличенное содержание гемоглобина в крови и миоглобина в миокарде, 3) оптимизированный энергетический метаболизм, 4) появление специфических нейрогуморальных факторов, простагландинов и стресс белков, 5) увеличенное содержание или активность антиоксидантов, и 6) высвобождение аденозина [Kolar, 1996].
Недавно было высказано предположение о том, что в защитный механизм ГТ вовлечен КАТФ канал [Asemu et al., 1999; Neckar et al., 2002; Zhu et al., 2003]. Так, показано, что у животных, подвергавшихся ГТ, защитный эффект тренировки при ишемии/ реперфузии (30 мин/30 мин) полностью блокировался глибенкламидом и 5-ГД. Следовательно, защитный эффект ГТ опосредуется КАТФ каналами [Zhu et al., 2003]. Усиление же кровотока не является основной причиной защитного действия ГТ [Zong et al., 2004].
Согласно данным Лукьяновой [Лукьянова, 2004], реакция организма на дефицит кислорода является отражением сложного полифункционального ответа клетки, координированного нейрогуморальными механизмами, где в общей иерархии внутриклеточных процессов энергетический обмен выполняет триггерную роль, а нарушение фукции митохондриальных ферментных комплексов являются базисным механизмом любой формы гипоксии. В то же время, вопрос о конечном эффекторе защитного действия ГТ остается открытым. Учитывая данные о роли митоКАТФ канала в кардиопротекции, опосредованной ишемической прекондицией [Garlid, 1997, Liu et al., 1998; Sato et al., 1998], мы предположили, что данный канал может быть вовлечен и в реализацию адаптации при ГТ. Для проверки данного предположения в настоящей работе были исследованы параметры дыхания и АТФ-зависимого калиевого транспорта МХ крыс с различной устойчивостью к ишемии, а также адаптированных к гипоксии.
2.3.1 Выделение МХ печени крысы
Для выделения МХ использовали самцов крыс альбиносов линии Вистар, массой ~250г. Крыс умерщвляли декапитацией без наркоза. Печень извлекали и помещали в предварительно взвешенную среду выделения (t 0°С). После определения массы и проведения перфузии 0.9% NaCl, печень продавливали через пресс и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 8-кратном объеме среды выделения, отнесенном к исходному весу ткани. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозы, 10 мМ Tрис-HCl, 0.5 мМ ЭГТА (pH 7,4).
Осаждение МХ проводили общепринятым методом дифференциального центрифугирования с модификациями, разработанными в нашей лаборатории (Миронова и др., 1981). К полученному осадку добавляли среду выделения в 0,1-кратном объеме к исходной массе ткани и гомогенизировали. Полученная суспензия МХ, использовавшаяся в дальнейшей работе, содержала 80-100 мг белка/мл.
Концентрацию белка в МХ определяли по методу Лоури [Лоури, 1951], используя бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве стандарта.
В работе использовали самцов крыс линии Вистар, массой ~250г. Предварительные процедуры как в п.п. 1.1. После определения массы сердца, ткань измельчали в растворе, содержащем 300 мМ сахарозы, 10 мМ Hepes, 2 мМ ЭГТА и 10% протеазы в течение 10 минут. Измельченную ткань гомогенизировали стеклянным гомогенизатором с тефлоновым пестиком в 8-кратном объеме среды выделения, отнесенном к исходной массе ткани. Среда выделения содержала 300 мМ сахарозы, 10 мМ Hepes, 2 мМ ЭГТА, 0.1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА) (pH 7.4).
МХ осаждали дифференциальным центрифугированием [Миронова и др., 1981]. К полученному осадку добавляли среду выделения в 0,1-кратном объеме к исходной массе ткани и гомогенизировали. Полученная суспензия МХ содержала 30-50 мг белка/мл.
Концентрацию белка в МХ определяли методом Лоури [Лоури, 1951].
Солюблизацию КАТФ канала из МХ печени крысы проводили по методу этанольной экстракции, разработанному в нашей лаборатории [Миронова и др., 1981] с некоторыми модификациями. Полученные МХ помещали на 20 мин в гипотонический раствор (концентрация белка составляла 3-4 мг/мл), содержащий 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5) при 4° С. Затем экстракт центрифугировали 20 мин при 5500 об/мин. Из полученного осадка митопластов экстрагировали белок. Для этого митопласты разводили 10 мМ Tрис-HCl буфером (рН-7,4) до концентрации 44 мг/мл. К суспензии добавляли 10-кратный водный раствор 66% этанола, охлажденный до -20˚С, и инкубировали при 4˚С в течение 30 минут при постоянном перемешивании. Полученный экстракт центрифугировали при 5500 об/мин в течение 15 минут. Супернатант диализовали против 5 мМ Трис-HCl буфера (рН 7,4) с добавлением 0,05% β-меркаптоэтанола в течение ночи при 4˚С при постоянном перемешивании с одной сменой буфера через 2 часа от начала диализа. Фракцию центрифугировали при 100000 g в ечение 1 часа.