Далее проводили ионообменную хроматографическую очистку полученного экстракта. Носитель - ДЕАЕ-целлюлоза (Sigma), объем колонки - 1 см3, диаметр – 0.5 см, h = 5 см. Скорость колонки - 40 мл/ч. Колонка уравновешивалась буфером, содержавшим 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА (рН 7,5). Этим же буфером далее элюировали несвязавшиеся с носителем белки. Связавшиеся белки элюировали двумя объемами ступенчатого градиента KCl (50, 100, 150, 200, 250, 300, 500 мМ KCl). После фракционирования белки каждой фракции идентифицировали методом SDS-PAAG электрофореза (10%). Гели окрашивали Кумасси-R250. Исследуемый белок с м.м. 55 кДа элюировался 250 мМ KCl.
Глава 3. Изучение энергозависимого входа К+ в МХ методом спектрофотометрии
В исследованиях использовались МХ сердца и печени крыс линии Вистар (масса животных ~250г.). Вход ионов калия определяли по скорости набухания МХ в гипотонической среде с KCl. Кинетику набухания регистрировали по изменению оптической плотности суспензии МХ при длине волны 520 нм при постоянном перемешивании и термостатировании при 26°С на спектрофотометре “Uvikon” (Италия). Концентрация МХ белка в ячейке составляла 0.1 мг/мл. Среда инкубации содержала: 50 мМ KCl, 5 мМ HEPES, 5 мМ NaH2PO4, 5мМ янтарной кислоты, 0.5 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭГТА, 5 мкМ цитохрома С, 2 мкM ротенона, 1 мкМ циклоспорина А, рН 7.2. Набухание инициировали добавлением МХ. Скорость набухания рассчитывалась по изменению светорассеяния за единицу времени.
3.1 Изучение ДНФ-индуцированного выхода ионов калия из МХ
Проницаемость митохондриальной мембраны оценивали с помощью К+-селективного электрода по содержанию и скорости выхода катиона из деэнергизованных МХ в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофенола (ДНФ). Кинетику выхода калия регистрировали с помощью оригинального электрометрического усилителя, который через контроллер L-153 был соединен с компьютером IBM PC486. Измерения проводились при постоянном перемешивании и термостатировании при 26°С. Концентрация МХ белка в ячейке составляла 1,5-2 мг/мл. Среда инкубации содержала: 0,3 М сахарозы, 3 мМ NaH2PO4, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,4.
3.2.1 Подготовка белка с м.м. 55 кДа: выделение и очистка
Выделение и первичная очистка белка проводились методами, описанными в п.п. 2. Белок хранили при температуре -20°С. Фракции, содержавшие белок с м.м. 55 кДа и обладавшие АТФ-ингибируемой К+-селективной активностью, накапливали, затем диализовали против 10 мМ Трис-HCl (рН 7.4) в течение ночи при постоянном перемешивании и температуре 4°С. Обессоленную фракцию концентрировали обратным диализом с использованием полиэтиленгликоля-20000 (ПЭГ) при 4°С. Сконцентрированную фракцию подвергали дополнительной очистке методом нативного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Для электрофореза использовали 10%-ый ПААГ в системе Дэвиса [Davies, 1964]. На геле наблюдалась только одна полоса - белковая зона, в которой определялась АТФ-зависимая К+-транспортирующая активность. Полосу исследуемого белка вырезали из геля, измельчали и элюировали в течение 12 часов при постоянной силе тока (8 мА) и температуре 4°С. Среда элюции содержала 10 мМ Трис-HCl, 38 мМ глицина, рН 8.3. Концентрацию белка в элюате определяли методом Лоури [Лоури, 1951]. Чистоту белка контролировали методом SDS-PAAG электрофореза [Laemmli, 1970]. Выход белка составлял около 30-50 мкг из 100 г ткани печени.
К+-транспортирующие свойства выделенного белка и чувствительность к аденозин-5’-трифосфату оценивали при встраивании его в бислойную липидную мембрану.
3.3 Иммунизация и анализ препарата антител
Для получения антисыворотки проводили иммунизацию животных электрофоретически чистым АТФ-ингибируемым К+-транспортирующим белком с м.м. 55 кДа (канальная субъединица митоКАТФ), выделенным из печени крысы. В качестве доноров иммунной сыворотки использовали кроликов массой 2.4-2.6 кг.
Схема процедуры была подобрана в соответствии с требованиями Декларации совета Европейского Союза 86/609/EEC.
За неделю до иммунизации животных дела проводили забор крови из ушной вены; сыворотка в дальнейшем использовали в качестве контроля.
Антиген, смешанный с неполным адъювантом Фрейнда (60-100 мкг белка с м.м. 55 кДа растворяли в 300 мкл 0.9 % NaCl и тщательно смешивали с 600 мкл неполного адъюванта Фрейнда) вводили животным подкожно в область лопаток. Гомогенность полученной смеси определяли визуально. Антиген вводили в 10 последовательных инъекций по 100 мкл на небольшом расстоянии друг от друга, чтобы минимизировать болевые ощущения. Через 3 и 6 недель проводили повторные иммунизации по той же схеме, однако для повторных инъекций использовали полный адъювант Фрейнда. Через 7-10 дней после последней инъекции брали кровь из ушной вены (40-50 мл), выдерживали 30 минут в открытом сосуде при комнатной температуре и оставляли на ночь при 4°С. Образовавшийся тромб удаляли центрифугированием (2000 об/мин), а обогащенную антителами сыворотку хранили в замороженном виде при температуре -20°С.
3.3.1 Детекция специфических антител и определение титра
Для определения титра полученных антител использовали белок с м.м. 55 кДа, полученный по схеме, описанной в п.п. 5.1.1. Белок в 10 мМ Трис-HCl, рН 7.4, в концентрации 1-2 мкг/мкл сорбировали на полосы нитроцеллюлозной мембраны, в количестве равном числу разведений первичных антител, подсушивали. Затем полоски нитроцеллюлозы инкубировали в ПБС-Твин буфере (0.15 М NaCl, 0.02 М NaH2PO4× 12 Н2О, рН 7.4, 0.1% Твин-20) в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого мембраны в течение часа инкубировали с ПБС-Твин-молоко буфером (ПБС-Твин 20 + 2% сухого молока (Amersham, Германия)) чтобы заблокировать участки, неспецифичного связывания с белком.
Буфер для блокирования удаляли и мембраны последовательно инкубировали сначала с первичными специфическими кроличьими антикрысиными антителами, а затем с вторичными антителами (козьи антикроличьи, Sigma), по 1 часу, отмывая мембрану ПБС-Твин-молоко буфере (смена буфера 4-5 раз в течение часа). При этом делали несколько разведений антисыворотки (1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400, 1:12800, 1:25600, 1:51200) в ПБС-Твин-молоко буфере. Каждую полоску нитроцеллюлозной мембраны с белком помещали в отдельную емкость и инкубировали с антителами определенного разведения. Разведение вторичных антител – 1:500.
Перед окрашиванием полосы мембран тщательно отмывали в ПБС-Твин буфере (4-5 смен буфера в течение 30-40 минут). Окрашивание проводили пероксидазной реакцией в присутствии 0.02% перекиси водорода. Буфер для окрашивания содержал 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5. Через 2-5 минут реакцию останавливали, промывая мембрану дистиллированной водой. Затем мембрану высушивали и хранили в темноте.
3.3.2 Вестерн-Блот анализ
Данный метод, впервые описанный Товбином и соавторами [Towbinetal., 1979] использовали для идентификации АТФ-зависимого К+-транспортирующего белка с м.м. 55 кДа в различных тканях животных.
На первом этапе проводили фракционирование МХ с помощью SDS-PAAG электрофореза [Laemmli, 1979]. Нагрузка составляла 5 мкг суммарного белка. Электрофорез вели при комнатной температуре и постоянном токе (20-30 мА на пластину) в течение 3-4 часов до достижения бромфеноловым синим нижнего фронта геля.
После электрофореза половину геля окрашивали Кумасси R-250 или серебрением [Shevchenkoetal., 1996], а вторую половину уравновешивали в буфере для блоттинга (150 мМ глицина, 20 мМ Триса, 0.02 % ДСН, 20 % метанол, рН 8.3) в течение 30 минут на качалке при комнатной температуре. Затем гель покрывали нитроцеллюлозной мембраной (Sigma, диаметр пор 0.45 мкм) и помещали между листами влажной фильтровальной бумаги. Систему помещали между двумя пористыми прокладками и зажимали между двумя пластинами из плексигласа. Перенос вели при напряженности 7 В/см2 в течение двух часов при комнатной температуре. После окончания переноса нитроцеллозную мембрану инкубировали в течение 30 минут в ПБС-Твин буфере при комнатной температуре. Дальнейшая процедура такая же, как в п.п. 5.2.1.
3.4 Исследование ДНФ-индуцированного выхода К+ из митохондрий с помощью К+-селективного электрода
Функционирование КАТФ-канала в митохондриях оценивали также по инициированной 2,4-динитрофенолом (ДНФ) скорости АТФ- зависимого выхода калия из митохондрий, т.е. создавали условия для работы канала в обратном направлении (Баранова и др, 2000). В среде без субстрата дыхания и калия регистрировали выход калия из митохондрий после добавления разобщителя окислительного фосфорилирования. Выход К+ из митохондрий индуцировали добавлением 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Кинетику выхода калия регистрировали с помощью оригинального электрометрического усилителя, который через контроллер L-153 был соединен с компьютером. Измерения производились при постоянном перемешивании. Концентрация митохондриального белка в ячейке составляла 1-1,5 мг/мл. Среда инкубации митохондрий содержала: 170 мМ сахароза, 80 мМ D-маннит, 5 мМ Na2HPO4, 10 мМ Трис-НCl (рН 7.4).
3.5 Реконструкция белка в БЛМ
Для реконструкции белка использовали БЛМ, сформированные из смеси 90 % общих липидов мозга быка и 10 % кардиолипина. Плоские бислои формировали методом Мюллера из липидов, растворенных в н-декане (Mueller et al, 1964). Суммарная концентрация липидов в н-декане равна 20 мг/мл. Трансмембранный ток регистрировали при постоянном напряжении на мембране. Проводимость немодифицированной мембраны составляла 1-3 пСм. Раствор белка вводили в буфер, омывающий одну из сторон мембраны. Буфер содержал: 20 мм Tris, 100 мМ KCl (рН 7,4). Регистрацию тока через ионные каналы в мембране проводили при помощи операционного усилителя с высокоомным сопротивлением в цепи обратной связи. Выход усилителя был подключен к компьютеру. Эксперименты проводились при 20-22ºС.