Параметры функционирования митоКАТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию (стр. 8 из 13)

Это свидетельствует об исходно меньшей экономичности процесса синтеза АТФ у низкоустойчивых животных. Таким образом, гипоксия, т.е. увеличение функциональной нагрузки на дыхательную цепь МХ при подъеме животных на высоту или при подаче воздуха со сниженной концентрацией кислорода, может привести к истощению резервных возможностей дыхательной цепи, что не происходит у высокоустойчивых животных.

Адаптация низкоустойчивых крыс интервальной нормобарической гипоксией по методу, предложенному в HypoxiaMedicalAcademy (США), проявляется у них в сопряжении дыхания, что, в свою очередь, выражается в снижении скорости дыхания, увеличении дыхательного контроля и сокращении времени, необходимого для фосфорилирования АТФ (Рис.9).

Рисунок 7. Скорость дыхания (А) и время фосфорилирования (Б) МХ сердца крыс низкоустойчивых и адаптированных к гипоксии

Как видно из рис. 7, при адаптации к недостатку кислорода животных низкоустойчивых к гипоксии, скорость дыхания МХ у них уменьшается. Кроме того, у адаптированных крыс сокращается время фосфорилирования и увеличивается значение дыхательного контроля (Рис.9 Б). Эти данные свидетельствуют о возрастании степени сопряженности дыхательной цепи МХ крыс низкоустойчивых к килородному голоданию при гипоксической тренировке.

Следовательно, адаптация приводит к переходу крыс из состояния низкой устойчивости в состояние повышеной устойчивости к гипоксии. Согласно данным Лукьяновой [Лукьянова, 2004] при адаптации крыс гипоксической тренировкой время жизни животного при подъеме на высоту, характеризующее общую неспецифическую резистентность крыс, у НУ животных увеличивается уже после первой тренировки на 120-160% (контроль принят за 0). У НУ время жизни в последующие 20 дней превышает исходную резистентность в 2 раза. У ВУ изменения во времени жизни вообще отсутствуют в первые 7 дней, после чего наблюдается небольшое увеличение, максимум до 40%. В работе делается вывод, что при адаптации гипоксической тренировкой наблюдается экономизация энергетических процессов МХ (Рис. 8).

Рисунок 8. Динамика изменения устойчивости к кислородной недостаточности при гипоксической тренировке животных с различной устойчивостью к гипоксии

Н/У – низкоустойчивые крысы, В/У – высокоустойчивые, С/У – животные со средней степенью устойчивости (выдерживающие подъем на высоту в 11500 м в течение 7 минут) [Лукьянова, 2004].

В случае, когда такая оптимизация уже существует, как у высокорезистентных животных, тренировки не приводят к увеличению времени жизни крыс в условиях гипоксии [Лукьянова, 2004]. Поэтому эксперименты по адаптации животных мы проводили на низкоустойчивых к гипоксии крысах.

3.1.2 Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ печени сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии

В работе были определены параметры АТФ-ингибируемого энергоависимого входа К⁺ в МХ крыс с различной резистентностью к гипоксии, а также низкоусточивых крыс после их адаптации интервальной нормобарической гипоксической тренировкой. Как следует из рисунка 9А, скорость входа К⁺ в МХ высокоустойчивых крыс существенно выше, чем в МХ низкоустойчивых животных.

Рисунок 9. Скорость энергозависимого входа К⁺ в МХ печени и сердца крыс с различной устойчивостью к гипоксии (А), а также в МХ животных, адаптированных к гипоксии Б

НУ – низкоустойчивые, ВУ – высокоустойчивые животные. Концентрация МХ белка в ячейке 0.1 мг/мл. Среда инкубации: 50 мМ KCl, 5 мМ HEPES, 5 мМ NaH₂PO₄, 5мМ янтарной кислоты, 0.5 мМ MgCl₂, 0.1 мМ ЭГТА, 5 мкМ цитохрома С, 2 мкM ротенона, 1 мкМ циклоспорина А, рН 7.2. Набухание инициировали добавлением МХ.

Рисунок 10. Скорость ДНФ-индуцированного выхода ионов К⁺ из МХ животных высоко-, низкоустойчивых к гипоксии и низкоустойчивых, адаптированных к гипоксии животных

ВУ – высокоустойчивые крысы, НУ – низкоустойчивые, Адапт. – низкоустойчивые, адаптированные к гипоксии. Измерения проводились при постоянном перемешивании и термостатировании при 26^°С. Концентрация МХ белка в ячейке составляла 1.5-2 мг/мл. Среда инкубации содержала: 0.3 М сахарозы, 3 мМ NaH₂PO₄, 10 мМ Трис-HCl, pH 7.4.

Гипоксическая тренировка приводит к увеличению скорости энергозависимого входа К⁺ до уровня, сравнимого с аналогичными показателями высокорезистентных крыс (Рис.9Б).

Эти данные коррелируют с результатами исследования ДНФ-индуцированного АТФ-зависимого выхода К⁺ из МХ, измеренного с помощью К⁺-селективного электрода (Рис. 10).

Следует также отметить, что адаптация приводит к изменению параметров ингибирования канала АТФ. Установлено, что К_i для АТФ в митоК_АТФ сердца существенно ниже у адаптированных и высокоустойчивых животных, по сравнению с низкоустойчивыми животными (Таблица 1), что является свидетельством более тонкой регуляции К⁺ транспорта при адаптации крыс к гипоксии.

Таблица 1. Константа ингибирования АТФ энергозависимого входа К⁺ в МХ сердца и печени крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у адаптированных к гипоксии

Устойчивость к гипоксии	K_i50, мкМ АТФ
Устойчивость к гипоксии	Сердце	Печень
Высокоустойчивые	18.06+5.38	51.81+18.05
Низкоустойчивые	26.30+8.55	71.69+8.32
Адаптированные	17.74+9.85	35.74+8.81

* Различия достоверны с p<0.05.

При увеличении скорости входа калия в МХ следовало ожидать значительного увеличения количества калия в МХ адаптированных животных, что приводило бы к существенному увеличению объема МХ матрикса. Однако концентрация калия в МХ высокоустойчивых и адаптированных к гипоксии крыс не только существенно не изменилась, но даже уменьшилась (Рис.11А, Б). Это означает, что объем МХ не увеличился, и даже немного сократился. Полученные данные указывают на то, что адаптация, по-видимому, приводит не только к интенсификации энергозависимого входа К⁺, но и к активации К⁺/Н⁺-обменника, который регулирует выход ионов калия из МХ.

Выброс калия из МХ при адаптации животных к гипоксии за счет интенсификации К⁺/Н⁺-обменника при активации митоК_АТФ позволяет поддерживать постоянный объем МХ и, вероятно, необходим для адаптации животных к гипоксии.

Возможно, при адаптации низкоустойчивых животных к гипоксии важное значение имеет активация не только системы АТФ-зависимого входа К⁺ в мтиохондрии, но и системы выхода этого иона. При этом снижение активности К⁺/Н⁺-обменника может быть причиной высокоамплитудного набухания и следующего за ним повреждения МХ при ишемии.

Рисунок 11. Количество К⁺ в МХ сердца крыс с различной резистентностью (А) и адаптированных к гипоксии (Б)

Измерения проводились при постоянном перемешивании и термостатировании при 26^°С. Условия как на рис. 10.

Известно, что при гипоксии недостаток кислорода приводит к восстановлению переносчиков дыхательной цепи, поскольку сток электронов на кислород затруднен [Лукьянова, 2004].

В соответствии с литературными данными восстановление переносчиков, локализованных на I и III комплексах дыхательной цепи, приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) [Kaplan-Bresler, 1965; Ferrantietal., 2003]. Как было показано ранее, главным участком образования АФК являются связанные с белком убисемихиноны, которые сопряжены по спину с железо-серным кластером [Ohnishietal., 2005].

МХ превращают несколько процентов потребляемого кислорода в АФК [Lenazetal., 2002]. Как было показано ранее, небольшие концентрации АФК необходимы для функционирования дыхательной цепи [KondrashovaandMironova, 1971]. В то же время, повышенное образование АФК при гипоксии служит основным повреждающим фактором [Starkovetal., 1997; Bargeretal., 2002].

Обнаруженная нами активация калиевого цикла, способствует слабому разобщению митохондрий и снижению мембранного потенциала. Известно, что незначительное снижение мембранного потенциала (~13%) ведет к существенному уменьшению продукции АФК (до 80%) [Korshunovetal., 1997]. Кроме того, было установлено, что активация канала сопровождается снижением концентрации АФК в клетке, способствуя сохранению уровня АТФ [Zweieretal., 1987; Painetal., 2000].

Этот предполагаемый механизм может объяснить защитную роль митоК_АТФ канала при реперфузии. Хорошо известно, что АФК являются основным повреждающим фактором при ишемии/реперфузии [Pearlsteinetal., 2002; Lietal., 2002], а активация митоК_АТФ канала приводит к сокращению уровня образования АФК во время фазы реперфузии [Zweieretal., 1987; Ozcanetal., 2002]. Полученные данные подтверждают развиваемую в лаборатории проф. Лукьяновой концепцию, что адаптация к гипоксии идет на фоне снижения свободнорадикальной активности, а не ее увеличения [Лукьянова, 2004].

Таким образом, полученные в работе результаты позволили доказать важную роль митоК_АТФ в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию, а также в адаптации животных к гипоксии. В работе предлагается также возможный механизм формирования такого типа адаптации.

5.2 Изучение структурной организации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала

Изучение структурной организации митоК_АТФ, учитывая его существенную физиологическую роль, особенно при гипоксии, является актуальной проблемой. Как было сказано в «Обзоре литературы», японские ученые полагают, что по структуре он близок к цитоплазматическому каналу [Suzuki et al., 1997]. Однако, проведенный в лаборатории проф. Гарлида анализ действия АТ к цито-KIR на АТФ-зависимый транспорт К⁺ в МХ не подтвердил эти данные [Grover and Garlid, 2000]. С другой стороны, в группе проф. Марбана было высказано предположение о том, что канал образован мультикомплексом, сосоящим из 5 МХ белков, одним из которых является АВС [Ardehali et al., 2004].Следовательно, структурная организация МХ АТФ-зависимого калиевого канала до настоящего времени окончательно не выяснена.