Список сокращение
Введение
1.1.2 Молекулярные структуры, ответственные за транспорт калия в МХ
1.1.4 АТФ-ингибируемые калий-транспортирующие каналы
1.2АТФ-зависимый калиевый канал цитоплазматической мембраны
1.2.1 Структурная организация цитоплазматического АТФ-зависимого калиевого канала
1.3 АТФ-чувствительный калиевый канал внутренней мембраны МХ
1.3.1 Структурная организация митоКАТФ канала
Глава 2. Модуляторы
2.1 Модуляторы митоКАТФ канала
2.1.1 Метаболические модуляторы митоКАТФ канала
2.2 Функциональная роль митоКАТФ
2.2.2 Механизмы защиты сердца при гипоксии, опосредованные активацией митоКАТФ
2.2.3 Феномен прерывистой гипобарической тренировки
2.3.1 Выделение МХ печени крысы
2.3.2 Выделение МХ сердца крысы
Глава 3. Изучение энергозависимого входа К+ в МХ методом спектрофотометрии
3.1 Изучение ДНФ-индуцированного выхода ионов калия из МХ
3.2.1 Подготовка белка с м.м. 55 кДа: выделение и очистка
3.3 Иммунизация и анализ препарата антител
3.3.1 Детекция специфических антител и определение титра
3.3.2 Вестерн-Блот анализ
3.4 Исследование ДНФ-индуцированного выхода К+ из митохондрий с помощью К+-селективного электрода
3.5 Реконструкция белка в БЛМ
3.6 Иммунноэлектронная микроскопия
3.7 MS-MALDI-TOF/TOF- анализ
3.8 Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа
3.9 Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа на колонке с иммобилизованным Белком А
Глава 4. Выделение комплекса цитоплазматических мембран и микросом печени крыс
4.1 Метод отбора высоко- и низкоустойчивых животных
5.1 Параметры функционирования митоКАТФ канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных, адаптированных к гипоксии
5.1.2 Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ печени сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии
5.1.2 Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ печени сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии
5.2 Изучение структурной организации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала
5.2.1 Определение гомологии белка с м.м. 55 кДа методом MS-MALDI-TOF/TOF
ЛИТЕРАТУРА
МитоКАТФ – митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал
ЦитоКАТФ – цитоплазматический АТФ-чувствительный калиевый канал
5-ГД – 5-гидроксидекановая кислота
Глиб – глибенкламид
АТФ – аденозин-5’-трифосфат
УТФ – уридин-5’-трифосфат
УДФ – уридин-5’-дифосфат
УМФ – уридин-5’-монофосфат
ГТФ – гуанин-5’-трифосфат
МХ – митохондрии
АТ – антитела
ФН – неорганический фосфат
АФК – активные формы кислорода
KIR – inward rectifying K+ channels (канальная субъединица митоКАТФ канала)
SUR – sulphonyl urea receptor (регуляторная субъединица митоКАТФ канала,
чувствительная к сульфонилмочевинам)
PCO’s – potassium channel openers (активаторы калиевых каналов)
NFBs – nucleotide phosphate binding domains (нуклеотидсвязывающиеучастки)
БЛМ – бислойные липидные мембраны
ФИА - феномен ишемической адаптации
ГТ – гипоксическая тренировка
НУ – крысы, низкоустойчивые к гипоксии
ВУ – крысы, высокоусточивые к гипоксии
Митохондриальный АТФ-ингибируемый калиевый канал (митоКАТФ), осуществляющий вход калия в МХ, был обнаружен методом пэтч-кламп во внутренней мембране МХ в 1991 г. [Inoue et al., 1991]. Однако, еще в 1981 г. в лаборатории проф. Мироновой был выделен белок с м.м. 55 кДа, обладающий свойствами данного канала. [Миронова и др., 1981]. Позднее было показано, что выделенный белок-канал ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996 (I)].
В настоящее время достаточно хорошо исследованы биофизические свойства митохондриального калиевого канала и его физиологическая роль [Миронова и др., 1996 (I, II); Paucek et al., 1992; Inoue et al., 1991; Garlid et al., 1997; Mironova et al., 1999; 2004]. Интерес к исследованию этого канала в последнее время возрос, поскольку было показано, что он, а именно его активация, играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии [Grover et al., 1992; Garlid et al., 1997; Vanden Hoek, 2000]. Найден целый ряд синтетических активаторов митоКАТФ, являющихся потенциальными кардиопротекторами [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Sato et al., 1998; Tsai et al., 2002]. Недавно в лаборатории проф. Мироновой был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоКАТФ – уридин-5’-дифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004; Негода А.Е., 2004]. Метаболические активаторы канала имеют ряд преимуществ, по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать и они не обладают отрицательными побочными эффектами. Действие УДФ, как активатора К+-канала, и, следовательно, кардиопротектора, до настоящего времени не было изучено на животных.
Помимо важной роли митоКАТФ в защите миокарда от ишемических повреждений, некоторые исследователи предполагают участие активации канала в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию [Zhu et al., 2003]. Однако прямые доказательства участия канала в адаптации к гипоксии до настоящего времени не получены, то есть, данный феномен также требует дополнительных исследований.
К настоящему времени нами разработана рабочая модель структуры и регуляции канала, в соответствии с которой митоКАТФ канал состоит из двух субъединиц – канальной (с молекулярной массой 55 кДа) и регуляторной (с молекулярной массой 63 кДа). Однако вопрос о структуре канала и возможной гомологии с другими белками пока остается открытым. Изучение структуры митоКАТФ позволит исследовать функцию и регуляцию канала на молекулярном уровне.
В связи с этим, целью данной работыбыло: изучить структурную организацию митоКАТФ канала, кардиопротекторное действие УДФ при ишемии миокарда, исследовать параметры функционирования митоКАТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию.
Таким образом, в работе были поставлены следующие задачи:
1) Исследовать параметры функционирования митоКАТФ у крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к недостатку кислорода.
2) Определить гомологию структуры исследуемого белка с м.м. 55 кДа аминокислотным последовательностям известных белков.
3) Получить специфические поликлональные антитела на белок-канал с м.м. 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ-ингибируемые К+ каналы.
4) Провести ингибиторный анализ АТФ-чувствительного транспорта калия в нативных МХ с использованием полученных антител (АТ) с целью доказательства принадлежности белка с м.м. 55 кДа к системе АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ.
5) Исследовать иммунолокализацию МитоКАТФ канала на срезе гепатоцитов и кардиомиоцитах при помощи электронной микроскопии
Транспорт К+ в митохондриях (МХ) имеет большое функциональное значение, так как концентрация К+ в цитоплазме значительно превышает концентрацию других катионов, и появление любой неконтролируемой проницаемости митохондриальной мембраны для К+ может представлять угрозу осмотической целостности и функциональной интегральности МХ [Brierley et al., 1983]. МХ занимают 40% внутриклеточного пространства в сердечной клетке и до 20% - в клетке печени и по данным [Rottenberg, 1973], в свободном состоянии в матриксе МХ содержится 95 нмоль К+/мг белка МХ, в слабосвязанном состоянии – 45 нмоль и в прочносвязанном – 5 нмоль. Концентрация свободного калия в цитоплазме составляет 90-120 нмоль.
Хемиосмотическая теория Митчела включает четыре постулата, последние два из которых имеют отношение к системе транспорта катионов. Согласно этим двум постулатам, внутренняя мембрана МХ: а) непроницаема для Н+, ОН- и всех прочих ионов; б) содержит ряд белков-переносчиков, осуществляющих транспорт неорганических ионов и необходимых метаболитов. Таким образом, по Митчелу, внутренняя мембрана МХ непроницаема для катионов и анионов. Однако из-за большого электрохимического потенциала [Δφ] (~ –200 мВ с матриксной стороны) одновалентные катионы (К+ и Na+) могут диффундировать через липидный бислой. Проблема такой утечки будет наиболее актуальна для ионов К+, как основного катиона цитозоля и матрикса, хотя скорость такой диффузии будет не велика.
Что касается специфических систем транспорта, то было установлено, что в МХ существуют системы: 1) электрогенного входа калия и 2) К+/Н+-антипортер [Chavez et al., 1977; Diwan, 1981; Garlid, 1980], о существовании которого говорил Митчел [Mitchell and Moyle, 1969].