Относительно недавно было обнаружено, что АПФ является также компонентом тканей, богатых фибриллярным коллагеном (матрикс сердечных клапанов, рубцы, образующиеся в результате инфаркта миокарда, и др.), и что его содержание повышается с усилением фиброза. Предполагается, что он может оказывать влияние на состав внеклеточного матрикса, в частности на синтез коллагена [22]. Кроме того, АПФ был обнаружен в атеросклеротических бляшках в стенках сосудов, что указывает на участие фермента в атеросклеротических процессах [67].
Фермент АПФ вовлекается в физиологический контроль за циркуляцией крови в послеоперационный период, регулируя калликреин-кининовую и ренин-ангиотензивую системы [48, 74]. В связи с этим представляет интерес изучения активности АПФ в сыворотке крови у онкологических больных в ранней послеоперационный период.
КПN (кининаза I, аргинин-карбоксипептидаза) впервые выделена и очищена Erdos и Sloane из плазмы крови человека. Фермент локализован в плазме крови, обнаружен в стенках кровеносных сосудов, слизистой оболочке носа, моче, имеется единичная работа по выделению фермента из микроворсинок плаценты человека.
Фермент имеет Mr 280 кДа и состоит из четырёх субъединиц трёх типов: двух с Mr 88 кДа и по одной с Mr 55 кДа и 48 кДа. Субъединицы с Mr 88 кДа гликозилированы (на долю углеводов приходится 29% массы), не обладают ферментативной активностью и, по-видимому, стабилизируют фермент в плазме крови [62]. Они содержат 12 богатых лейцином областей, участвующих в связывании с активными субъединицами [70]. Субъединицы с Mr 48 кДа и 55 кДа обладают ферментативной активностью и не содержат в своём составе углеводных остатков. Ограниченное протеолитическое расщепление субъединицы с Mr 55 кДа сериновыми протеиназами приводит к превращению её в субъединицу с Mr 48 кДа, более глубокое расщепление даёт два фрагмента с Mr 27 и 21 кДа. Образовавшиеся фрагменты в ассоциированном состоянии обладают большей активностью, чем нативные субъединицы, но стабильность фермента при этом снижается.
КПN содержит в активном центре ион Zn2+, проявляет максимальную активность при pH 7,0-7,8, сохраняет около 50% от максимальной активности при pH 6,0 [55, 58]. Фермент ингибируется ЭДТА и о-фенантролином, МГТК (Ki = 0,5 мкМ), ГПЯК (Ki = 0,9 мкМ), ГЭМЯК (Ki =1,5 мкМ), АПМЯК (Ki = 52 мкМ), гистаргиноми протамином (Ki = 0,32 мкМ) [56, 66]. Несмотря на то, что дитиотреитол значительно активирует фермент, 2-меркаптоэтанол и реагенты на сульфгидрильные группы ПХМФС и ПХМБ не влияют на его активность. ФМСФ, ДФФ и апротинин также не влияют на активность фермента.
КПN отщепляет остатки аргинина и лизина с C-конца различных синтетических пептидов, при этом скорость расщепления субстратов, содержащих C-концевые остатки лизина в 5-6 раз выше, чем соответствующих пептидов с C-концевым аргинином [57]. КПN отщепляет C-концевые остатки аргинина и лизина от многих природных пептидов и белков: брадикинина (значение Km по данным разных авторов составляет от 0,4 до 19 мкМ), Met5-энкефалин-Arg6 (Km = 49 мкМ) [69], Leu5-энкефалин-Arg6 (Km = 57 мкМ), Met5-энкефалина-Lys6 (Km = 216 мкМ), анафилотоксинов [49],креатинкиназы [75], a-енолазы [76], фибринопептидов .
Несмотря на многолетнюю историю изучения КПN, её биологическая роль во многом остаётся неясной. Фермент вначале был описан как карбоксипептидаза, инактивирующая брадикинин и, следовательно, способная вовлекаться в регуляцию артериального давления и тонуса кровеносных сосудов. Однако показано, что реальный вклад фермента в инактивацию брадикинина in vivo не превышает 10-12%. Вместе с тем, некоторые авторы предполагают, что КПN может играть роль модулятора действия брадикинина [55, 69].
Активность КПN изменяется при воспалении, при некоторых видах астмы, послеоперационных осложнениях. Поскольку фермент расщепляет пептиды, участвующие в развитии воспалительных реакций (брадикинин и анафилотоксины), и его активность в крови снижается при введении рекомбинантного интерлейкина-1b, вероятно, что КПN вовлекается в развитие воспалительных реакций [48].
Так как активность фермента повышается в моче больных с первичным альдостеронизмом, то, возможно, что активность КПN в почках может регулироваться альдостероном. Не исключено, что фермент может играть некоторую роль в регуляции водно-солевого обмена в почках.
Поскольку очищенная КПN способна уменьшать связывание плазминогена с клетками, хотя и не уменьшает скорости полного лизиса сгустка крови, можно предположить, что она вовлекается в процессы коагуляции крови. Однако, её реальный вклад в этот процесс in vivo пока не ясен.
Таким образом, несмотря на предположения, что КПN возможно вовлекается в регуляцию артериального давления, тонуса кровеносных сосудов, развитие воспалительных реакций, процессы свёртывания крови, её биологические функции не совсем ясны. Представляется возможным, что она вносит вклад в расщепление многих эндогенных субстратов и регуляцию многих физиологических процессов, однако в подавляющем большинстве случаев она не является единственным ферментом, участвующем в том или ином процессе. Вместе с тем, разнообразные функции вызывают интерес к изучению фермента при самых различных состояниях организма, в том числе связанных с нарушениями гемостаза [10].
В связи с этим представляет интерес изучения активности КПN в сыворотке крови онкологических больных в раннем послеоперационном периоде.
гемостаз онкологический больной карбоксипептидаза
1.2.4 Изменения в пептидергической системе онкологических больных
Интерес к изучению протеолитических ферментов при злокачественных новообразованиях обусловлен их разнообразным влиянием на процесс канцерогенеза [13, 15]. В работе И. Л. Вовчука, А. Е. Дизика, М. Г. Ануфриева и др. было проведено сравнительное изучение протеиназной активности сыворотки крови у женщин с онкологическими заболевания эндометрия, при этом установлена обратнопропорциональная зависимость между активностью трипсиноподобных протеиназ в сыворотке крови и степенью дифференциации злокачественной опухоли. При гиперплазии наибольшая активность трипсиноподобных протеиназ в сыворотке крови наблюдается при аденоматозе, а наименьшая – при эндометриозе [15].
Наличие злокачественной опухоли в матке характеризовалось увеличением активности трипсиноподобных протеиназ в сыворотке крови по сравнению с показателями доноров: у женщин в возрасте от 51 до 60 лет – в 1,24 раза, у женщин в возрасте от 61 до 70 – в 2,0 раза. По сравнению с доброкачественными опухолями активность исследуемых протеиназ при наличии злокачественного процесса была выше в 1,4 раза. Следует отметить, что у больных старше 70 летустановили значительно более высокую (в 3,78 раза) протеиназную активность при наличии злокачественной опухоли. В то же время в этой возрастной группе показатели протеиназной активности как при наличии доброкачественного, так и злокачественного процесса, были в 3,3 и в 2,0 раза ниже, чем в других возрастных группах. Это можно объяснить, вероятнее всего, снижением скорости метаболических процессов, свойственных данному возрасту [31].
Снижение протеиназной активности в сыворотке крови при наличии доброкачественной опухоли и увеличение этого показателя в случае злокачественной опухоли может свидетельствовать, с одной стороны, о неспецифичности ответной реакции организма, а с другой - об отличии протеиназ тканей доброкачественной и злокачественной опухолей.
На основании полученных исследоватили предполагают, что наличие достаточно высокой активности трипсиноподобных протеиназ (выше 36,00 нмоль/мин на 1 мг белка) может свидетельствовать о плохом прогнозе заболевания и, вероятно, показания протеиназной активности свыше 100,00 нмоль/мин на 1 мг белка могут свидетельствовать об активно идущих процессах трансформации клеток, которые наблюдаются при аденоматозе (cancer in situ) [6, 15, 41].
Глава 2. Материалы и методы исследования
Активность ферментов определяли в сыворотке крови онкологических больных. Кровь брали в первый день после операции из локтевой вены, далее ее инкубировали 30 минут при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут при 4000g и получали сыворотку, в которой определяли активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента.
Изучение активности ферментов было проведено у 45 мужчин в возрасте от 49 до 70 лет. Больные были оперированы по поводу опухолей легких, брюшной полости и мочеполовой системы. Они составили три экспериментальные группы. Первая группа – больные торакального отделения (18 человек); вторая – абдоминального отделения (15 мужчин); третья – урологического отделения (12 человек).
Параллельно с нашим исследованием Корниенко Е. М. проводилась работа по определению параметров гемостаза у онкологических больных данных групп, которые мы использовали в своей работе.
2.2 Методы исследования
2.2.1 Метод определения активности карбоксипептидазы N
Активность КПN определяли в сыворотке крови нингидриновым методом [62].
Опытные пробы содержали 20 мкл 3,5 мМ раствора CoSO4, приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Контрольные пробы содержали 20 мкл 100 мМ Трис-HCl, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Пробы преинкубировали 8 мин при 37oC, реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 10 мкл гиппурил-арг, приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 (конечная концентрация в пробе 5 мкМ). Реакцию проводили 120 мин при 37oC и останавливали прибавлением 30 мкл 10 % трихлоруксусной кислоты.
Пробы центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин, отбирали 50 мкл надосадочной жидкости, приливали 1 мл нингидринового реактива. Далее пробы встряхивали, выдерживали 12 мин на кипящей водяной бане и измеряли оптическую плотность на КФК-2 при 595 нм против H2O [58].
Активность КПN определяли как разность оптической плотности опытных и контрольных проб и выражали в нмоль аргинина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.