Наружная мембрана лептоспиры весьма необычна, поскольку является самой жидкой из известных на сегодняшний день. Находящиеся в ней наружные мембранные протеины при движении всегда (даже при изменении направления) смещаются в задний конец клетки. Скорость дрейфа антигенов в мембранах приблизительно составляет 11 мкм/сек.
Оболочка клетки окружает так называемый «протоплазматический цилиндр». Благодаря укорочению закрученных вокруг него осевых нитей последний имеет винтообразную форму.
Два жгутика (осевые нити) диаметром 20–30 нм локализуются в периплазматическом пространстве между наружной мембраной и пептидогликановым слоем оболочки. Их свободный конец уже внутриклеточного. Аксиальная нить состоит из сердцевины диаметром 11,3 мкм, окруженной 2 мембранными слоями толщиной 21,5 и 42 микрон. Она прикрепляется крючком к базальному тельцу на противоположном конце периплазматического цилиндра и идет вдоль оси клетки приблизительно до ее центра. Аксиальные нити не перекрываются между собой, как это имеет место у других спирохет. Структура базальных телец жгутиков такая же, как и у других грамотрицательных бактерий. Аксиальные нити обеспечивают движение и сохранение лептоспир своей формы. В культурах лептоспиры нередко образуют клубки, а по мере старения в них появляются дегенирирующие формы с атипичной морфологией.
Прохождение на питательных средах более 20 пассажей ведет к изменению морфологии лептоспир – увеличению длины и количества завитков спирали, а также уменьшению количества электронно-прозрачных протоплазматических включений.
– Культуральные свойства
Лептоспиры являются аэробами, их культивируют на средах слабощелочной реакции (рН 7,2–7,4) при 24 – 28 °С. Культивирование лептоспир связано с определенными трудностями, обусловленными их низкой способностью к размножению в жидких, полужидких и особенно на плотных искусственных питательных средах. На простых питательных средах лептоспиры не растут. Для их культивирования наиболее часто используют жидкие среды Любашенко, Терских, Ферворт – Вольфа, содержащие 5–10% сыворотки крови кроликов, а также среду ГНКИ с альбумином. Максимальное накопление биомассы лептоспир отмечается по истечении 5–7 сут. культивирования, при этом вид питательных сред не изменяется.
Патогенные лептоспиры являются аэробными (часто микроаэрофильными) спирохетами. Invitro при хорошей аэрации, pH 7,2–7,4 и оптимальных условиях инкубирования (температуре 28– 30°C для большей части сероваров и 30–32°С для L.canicola) они культивируются намного лучше, чем другие спирохеты. Границы температуры инкубации посевов, в пределах которых возможен рост лептоспир, составляют 22–37°С.
Для нормального роста они нуждаются в липидах и ненасыщенных жирных кислотах, а также витаминах В1 и В12. Наличие белка в питательной среде для лептоспир не обязательно. Из числа аминокислот только аспарагин оказывает на них стимулирующее действие. Его можно заменить полисорбатами. Обработка твина поливинилпирролидоном устраняет его токсичность для лептоспир. В средах без протеина, но с обработанным этим способом твином урожай лептоспир достигает 108 кл/мл. Неплохой альтернативой твину-80 является пируват натрия, который добавляют в среды в концентрации 100 мкг/мл. Наличие в субстрате сахаров угнетает их рост.
Наиболее интенсивно лептоспиры растут на жидких и полужидких питательных средах с 5–10% сыворотки крови кролика или барана (вместо сыворотки часто применяют сывороточный альбумин). Время развития одной генерации лептоспир в логарифмической фазе составляет 58–68 ч, поэтому максимальный рост наблюдают на 5–10 дн.
Классической питательной средой для лептоспир является среда Ногуши-Веньона. Наибольшее распространение в работе с ними получили жидкие (Уленгута, Ферворта-Вольфа в модификации Тарасова, Кортхофа и др.) и полужидкие (Флетчера и др.) агаровые среды (ПРЛ 10:2).
На жидких средах эти спирохеты растут медленно – максимальный урожай бактерий обычно получают на 5–10 дн культивирования. При микроскопировании препаратов культур в этот период в одном поле зрения (окуляр х10, объектив х40) обычно обнаруживают около 100 подвижных бактерий. Культуры лептоспир в жидких средах бесцветны, не имеют запаха, при бурном росте опалесцируют. Опалесценция лучше видна в проходящем свете при легком встряхивании пробирки.
В полужидких средах на 1,5-2 см ниже поверхности появляется помутнение в виде кольца, интенсивность которого усиливается по мере роста лептоспир. В средах с 1% агара эти бактерии формируют преимущественно заглубленные колонии, контуры которых могут быть четкими или размытыми. Тенденция к заглубленному росту (феномен Дингера), обеспечивающая некоторое ограничение доступа кислорода, свидетельствует о микроаэрофильности лептоспир.
В средах с 2% агара лептоспиры образуют поверхностные колонии, имеющие разную степень прозрачности вплоть до трудно различимых при обычном освещении. Пассирование изолятов invivo повышает частоту образования такого типа колоний, в то время, как многократные пересевы invitro способствуют усилению заглубленного роста. Чем чаще делают пересевы, тем быстрее получают пышный рост культур.
Фосфомицин (400 мкг/мл) в сочетании с 5-флуорацилом (100 мкг/мл) при добавлении в среду ингибируют размножение посторонней микрофлоры, не влияя на рост лептоспир. Это позволяет использовать их в селективных средах. В качестве селективных компонентов сред применяют также мочевину, соли кобальта и антимикробные препараты (неомицин, рифампицин, фурацилин, фурагин, налидиксовую кислоту, комбинации рифампицина, полимиксина В, бацитрацина и актидиона.
В процессе хранении музейных штаммов лептоспир их пересевают не реже 1 раза в месяц. Для длительного хранения культуры заливают слоем стерильного вазелинового масла или запаивают в ампулы, что предупреждает испарение среды и изменение ее рН.
Патогенные лептоспиры в процессе культивирования invitro постепенно утрачивают свою вирулентность. Последнюю часто удается восстановить посредством заражения чувствительных животных, например, молодых морских свинок (36).
– Биохимические свойства
Лептоспиры – хемоорганотрофы с дыхательным типом метаболизма. Повышенная чувствительность к солям синильной кислоты, а также результаты спектроскопических исследований свидетельствуют об участии в их дыхании цитохромной системы. Они оксидазонегативны, но каталазо- и / или пероксидазопозитивны.
Эти микроорганизмы проявляют выраженную аминопептидазную активность при отсутствии протеолитических свойств. По механизмам синтеза изолейцина разные лептоспирsразличаются, что дает основание для разделения их на 3 класса.
• Микроорганизмы класса 1 осуществляют это обычным треониновым путем,
• Представители класса 3 – уникальным (пируватным) способом,
• Остальные лептоспиры, вошедшие в класс 2, обоими способами.
Лептоспиры способны утилизировать азот из мочевины, креатинина и саркозина, что протекает под контролем ферментов микроорганизмов – аланин дегидрогеназы, глютамат дегидрогеназы и глютамат пируват трансаминазы.
В клетках лептоспиры обнаружены следующие липидные компоненты: свободные жирные кислоты (41,8%), мажорный фосфолипид (14,8%), фосфатидилэтаноламин (12,9%), эфир холестерина (CE) (9,3%), липофосфатидилэтаноламин (4,9%) и дифосфатидилглицерин (1,1%). Свободные жирные кислоты представлены гексадеканоиковой (26,9%), гексадеценоиковой (15,4%), октадеценоиковой (26,5%) и октадекадиеноиковой (27,4%) кислотами. В состав мажорного фосфолипида входят тетрадекадиеноиковая (53,6%), тетрадекатриеноиковая (14,0%) и октадектадеканоиковая (13,8%) жирные кислоты. Фосфолипид с полиненасыщенными жирными кислотами и 14 атомами углерода в молекуле выявлен только у вирулентных штаммов и отсутствует у авирулентных.
– Биопроба
Лептоспиры могут быть выделены из патологического материала посредством его инокуляции лабораторным животным: кроликам-сосунам, золотистым хомячкам, степным пеструшкам (10–30-дневного возраста) и сусликам, поскольку перечисленные животные в равной степени чувствительны к возбудителям как «желтушных», так и «безжелтушных» лептоспирозов. Другие виды лабораторных животных проявляют неодинаковую чувствительность к разным сероварам лептоспир. Молодых морских свинок и белых мышей (массой 10–14 г.) используют при подозрении на инфекцию серовара icterohaemorrhagiaee.
Гепаринизированную кровь, мочу, спиномозговую жидкость или суспензию гомогената внутренних органов подозреваемой в заражении ЛС собаки, а также тестируемые корма и воду вводят лабораторным животным подкожно, через скарифицированную кожу, закапыванием в глаза, внутрибрюшинно, внутривенно, интракардиально и перорально.
У молодых кроликов, золотистых хомяков и сусликов инфекция «желтушных» и «безжелтушных» лептоспир вызывает развитие таких же клинических и патоморфологических изменений, как и у других видов лабораторных животных при инфекции L.icterohaemorrhagiaee. После инкубационного периода, составляющего в зависимости от патогенности штамма агента от 2 до 7 дн (реже более) температура тела поднимается до 39–41°С, животные отказываются от корма и быстро теряют в весе. У них развивается инъекция сосудов склеры глаз. На 2–5 дн клинической стадии инфекции на фоне резкого истощения температура их тела снижается ниже нормы, появляется желтушность склеры глаз, видимых слизистых оболочек и кожи. Усиленно выпадают волосы. Заболевшие животные в большинстве случаев погибают на 4–12 дн после заражения.
На их вскрытии обнаруживают желтушность тканей, особенно подкожной клетчатки, кровоизлияния во внутренних органах, коже, подкожной клетчатке, которые наиболее интенсивны в паховой и подмышечной областях. Типичны крупноточечные кровоизлияния в легочной ткани, которые выделяясь на общем ишемическом фоне придают легким сходство с крыльями бабочки. В печени находят красновато-желтые некротические очаги. В следствии острого нефрита почки увеличены, надпочечники гиперемированы.
В течение инкубационного периода и всей клинической стадии инфекции лептоспиры циркулируют в крови животного. С появлением желтухи их обнаруживают во внутренних органах (особенно часто в печени).