Препарат «толстая капля» готовят двумя способами: а) к капле крови на месте прокола (на пальце, мочке уха) прикасаются предметным стеклом и круговыми движениями распределяют каплю до диаметра 15—20 мм, на предметное стекло целесообразно нанести 2 капли; б) на предметном стекле готовят вначале мазок несколько толще обычного, затем, пока он еще не высох, на него наносят 1 или 2 капли крови, которые спонтанно растекаются равномерными дисками. Подсыхать «толстые капли» должны постепенно на воздухе, без подогрева, в условиях защиты их от повреждения насекомыми. Препараты крови окрашивают без предварительной фиксации по Романовскому—Гимзе.
Для приготовления тонкого мазка делают отпечаток крови вблизи края предметного стекла, затем ребром под углом 45° подводят к капле шлифованное стекло и после растекания крови вдоль его края непрерывным движением распределяют кровь по поверхности предметного стекла. Полученный препарат фиксируют и окрашивают.
Спинномозговую жидкость для микробиологического исследования отбирают в стерильную пробирку во время люмбальной пункции. Для приготовления препарата используют осадок, образующийся спонтанно или в результате центрифугирования.
Мазки со слизистой оболочки ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном, мазок-отпечаток готовят на предметном стекле. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают стерильным ватным тампоном, который вводят вглубь полости носа. Мазок из носоглотки берут стерильным заднеглоточным тампоном, вводя его осторожно через носовое отверстие в носоглотку. Для проведения анализов на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки. Материал из носа и глотки берут разными тампонами.
Мочу для микроскопического исследования собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Для приготовления препарата используют осадок мочи.
Микроскопическому исследованию подвергают нативные (нефиксированные, неокрашенные) и окрашенные препараты. В первом случае выявляют живые микроорганизмы в препарате «висячая капля» или «раздавленная капля», оценивая подвижность и морфологические свойства возбудителя. Например, темнопольную микроскопию нативных препаратов используют для диагностики спирохетозов (первичного сифилиса, лептоспироза, эпидемического (вшиного) возвратного тифа), кандидоза или других грибковых заболеваний. В этих случаях результат микроскопического исследования дает основание для постановки диагноза.
Наиболее широко применяют микроскопию микроорганизмов в окрашенном состоянии, в частности для диагностики паразитарных болезней (малярия, амебиаз, лямблиоз, лейшманиоз, гельминтозы). Для окраски препаратов используют ориентировочные, специальные и дифференцирующие методы. Ориентировочная окраска позволяет оценить общую морфологию микроорганизма. С этой целью применяют стандартные красители — фуксин или метиленовый синий.
Среди специальных методов наиболее часто используют окраску по Граму. Этот метод выявляет способность бактерий удерживать краситель кристаллический фиолетовый (или генциановый фиолетовый) либо обесцвечиваться в спирте. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный, так как они обесцвечиваются в спирте и их дополнительно окрашивают фуксином. Окраска возбудителей по Граму позволяет определить первичный выбор средств антибактериальной терапии.
К специальным методам относят окраску по Цилю— Нильсену, выявляющую кислото- и спиртоустойчивые палочки, в частности микобактерии туберкулеза, которые окрашиваются в красный цвет, а остальные микроорганизмы — в синий.
Дифференцирующими называют методы окраски отдельных элементов бактериальной клетки. Например, окраска метахроматиновых (волютиновых) включений в бактериях (по Нейссеру, Майеру), окраска капсул (по Гиссу, Лейфсону, Антони), спор, жгутиков (по Леффлеру, Бейли, Грею и др.), клеточной стенки, хроматиновых (ядерных) элементов (по Романовскому—Гимзе и Пекарскому).
К микроскопическим методам исследования относят иммунофлюоресценцию (люминесцентная микроскопия), используемую для диагностики бактериальных и вирусных инфекций и основанную на применении антител, меченных флюоресцирующим красителем. Более подробно данный метод рассматривается в разделе «Иммунологические методы исследования».
Эффективность микроскопического метода определяется его чувствительностью и специфичностью. Специфичность ограничивается возможной ошибочной идентификацией возбудителя из-за артефактов. Кроме того, при проведении микроскопического исследования имеют значение техника исследования; например, при диагностике малярии чувствительность исследования крови методом «толстой капли» в 20—40 раз выше, чем при исследовании методом тонкого мазка, поскольку данный препарат позволяет просматривать больший объем крови, а кроме того, плазмодии в препарате располагаются внеклеточно, что облегчает их обнаружение и количественную оценку.
Тем не менее чувствительность метода «толстой капли», проводимого по стандартам ВОЗ (исследование минимум 100 полей зрения в течение минимум 5 мин), все же не превышает 95 % из-за неравномерности распределения малярийных плазмодиев крови, особенно при низком уровне паразите-мии.
Важным способом повышения чувствительности микробиологического метода является использование различных способов концентрации патогенов, например осаждение или флотация пробы при исследовании кала и фильтрация через миллипоровые фильтры проб крови, мочи, спинномозговой жидкости.
Повышению эффективности микроскопического исследования способствует количественное определение выявленного паразита в поле зрения или единице объема исследуемого материала. В частности, при малярии (особенно при обнаружении P.falciparum) важно определение интенсивности паразитемии.
Количественная оценка микрофлоры в мазке, а также выявление микробных ассоциаций важны в случае необходимости определения этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. Известно, что максимальная определяемая концентрация бактерий в мазке из нативного материала составляет 1Сг клеток в 1 мл.
Для большинства видов исследуемого материала этиологически значимым считается обнаружение условно-патогенных бактерий определенного вида в концентрации не менее 105—106 клеток в 1 мл, поэтому чувствительность микроскопического метода в большинстве случаев удовлетворяет потребностям клинической микробиологии.
3.2 Бактериологический метод
Применение бактериологического метода дает возможность выделить возбудителя в чистой культуре из материала, полученного от больного, и идентифицировать его на основании изучения комплекса свойств. Большинство бактерий способны к культивированию на различных искусственных питательных средах (кроме хламидий и риккетсий), поэтому бактериологический метод имеет важное значение в диагностике многих инфекционных болезней.
В случае получения положительного результата бактериологический метод позволяет определить чувствительность выделенного возбудителя к антимикробным препаратам. Однако эффективность указанного исследования зависит от многих параметров, в частности от условий сбора материала и его транспортировки в лабораторию.
К основным требованиям, предъявляемым к отбору и транспортировке материала для бактериологического исследования, относят:
• взятие материала до начала этиотропного лечения;
• соблюдение условий стерильности при сборе материала;
• техническую правильность сбора материала;
• достаточное количество материала;
• обеспечение температурного режима хранения и транспортировки материала;
• сведение к минимальному промежутка времени между сбором материала и посевом на плотные питательные среды.
Транспортировка материала в лабораторию должна быть осуществлена по возможности немедленно, но не более чем в течение 1—2 ч после его взятия. Пробы материала должны находиться при определенном температурном режиме; в частности, стерильные в норме материалы (кровь, спинномозговая жидкость) хранят и доставляют в лабораторию при 37 °С. Нестерильные материалы (моча, отделяемое дыхательных путей и др.) хранят при комнатной температуре не более 1—2 ч или не более суток при 4 °С (условия бытового холодильника). При невозможности доставки проб в лабораторию в регламентированные сроки рекомендуют использовать транспортные среды, предназначенные для сохранения жизнеспособности возбудителей в условиях консервации.
• Кровь для исследования следует брать у больного в период подъема температуры тела, в начале появления лихорадки. Рекомендуется исследовать 3—4 пробы крови, взятые с интервалом 4—6 ч, что обоснованно с точки зрения снижения риска «упустить» транзиторную бактериемию и повышения возможности подтвердить этиологическую роль выделенной из крови условно-патогенной микрофлоры (например, Staphylococcusepidermidis), если эта микрофлора обнаруживается в нескольких пробах венозной крови. Пробу крови в количестве 10 мл у взрослого и 5 мл у детей засевают минимум в два флакона со средой для аэробных и анаэробных микроорганизмов в соотношении 1:10. Желательно однократное исследование и артериальной крови.
• Взятие спинномозговой жидкости (СМЖ) производит врач при люмбальной пункции в количестве 1—2 мл в сухую стерильную пробирку. Пробу немедленно доставляют в лабораторию, где к ее исследованию приступают также немедленно. При отсутствии такой возможности материал сохраняется при 37 °С в течение нескольких часов. Существенно повышает количество положительных результатов бактериологического исследования посев 1—2 капель СМЖ в пробирку, содержащую полужидкую среду с глюкозой, и в чашку Петри с «кровяным» агаром. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термосы или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 37 °С.