Патоморфологические изменения в органах крыс при моделировании реперфузионного синдрома (стр. 1 из 3)

В.З. Харченко, А.В. Кубышкин, Л.Л. Алиев, И.И. Фомочкина

Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского, кафедра патологической физиологии, г. Симферополь

Реперфузионный синдром (РС) представляет собой сложный комплекс нарушений, возникающих в результате восстановления кровотока в ранее ишемизированной ткани. Расстройства, вызванные ишемией и последующей реперфузией тканей, наблюдаются в кардиологической, ангиохирургической, травматологической, неврологической практике [1, 2].

Патогенез ишемических и реперфузионных расстройств органов и тканей имеет сложный и многокомпонентный характер.Важнейшая роль в патогенезе реперфузионного синдрома принадлежит системной активации протеолитических ферментов, которая происходит в результате повышения проницаемости клеточных мембран, экзоцитоза лейкоцитов [3, 4, 5]. При этом повышение протеолитической активности в сыворотке крови сопровождается угнетением функции сывороточных и тканевых ингибиторов протеолиза [6, 7]. Высвобождение, активация и поступление протеолитических ферментов в системный кровоток приводит к нарушению функции калликреин-кининовой системы, свертывания крови, системы комплемента [4]. Регуляторные плазменные системы влияют на активность тканевых базофилов, тромбоцитов, макрофагов, моноцитов, способных выделять мощные медиаторы воспаления [8]. Кроме того, развитие РС сопровождается интенсификацией процессов свободнорадикального окисления (СРО) липидов [9, 10].

С учетом механизмов развития реперфузионного синдрома, при формировании которого происходит накопление и массивное поступление в системный кровоток биологически активных веществ, характерных для воспалительного процесса, можно предположить, что при изучаемой патологии возникает системная воспалительная реакция, которая может быть ключевым фактором в развитии органопатологии при критических состояниях.

Основная сущность синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) заключается в генерализации базисных механизмов воспалительного процесса, ассоциированных с очагом воспаления и предназначенных для локального, но не системного действия [11, 12, 13, 14, 15].

Учитывая выраженные метаболические нарушения и, исходя из взаимосвязи структуры и функции, представляет интерес изучение морфологических изменений во внутренних органах при системном воспалении на модели реперфузионного синдрома.

Материал и методы

Экспериментальные исследования проведены на 40 белых крысах-самцах линии «Vistar», массой 180-200 грамм. Животные содержались в стандартных идентичных условиях, что необходимо для создания структурной группы. Экспериментальные исследования проводились в соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в исследовательских и других научных целях» (Strasburg, 18.03.1986) и постановления Первого национального конгресса по биоэтике (Киев, 2001) [16].

Исследование проводили на модели реперфузионного синдрома. РС моделировали путем наложения резиновых жгутов на обе задние конечности животных на уровне паховой складки сроком на 6 часов под легким эфирным наркозом. Ширина пережатия тканей составляла 2-3 мм. Критерием состоятельности наложения жгута являлось отсутствие отека конечности и бледность их окраски. Забой животных и забор биологического материала осуществляли через 6, 12 и 24 часа после реваскуляризации конечностей, Морфологические изменения исследовали в тканях сердца, легких, почкек, печени, из которых вырезали фрагменты ткани размерами 1см х 1см х 1см, предназначенные для гистологического исследования, с последующей фиксацией в 10 % растворе нейтрального формалина. Минимальный срок фиксации составлял 10 дней, в течение которых фиксирующая жидкость сменялась дважды. Фиксатор отмывали в проточной водопроводной воде 24 часа. Ткань обезвоживали в батарее спиртов восходящей концентрации (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 96 % и абсолютный спирт), просветляли в ксилоле, выдерживали в насыщенном при +37 ºС растворе парафина в ксилоле, затем помещали в парафин при +56 ºС, с последующей заливкой в смесь парафина и пчелиного воска и изготовлением парафиновых блоков, из которых готовили серийные срезы толщиной 4-5 мкм. С целью обзорной окраски, гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Для выявления компонентов соединительной ткани окрашивали пикрофуксином по Ван Гизону, соединительнотканные волокна окрашивались в красный цвет. Просмотр и цифровые фотографиимикропрепаратов осуществляли с помощью светового микроскопа «Olympus CX-41».

Фиксацию материала для электронной микроскопии осуществляли 2,5% раствором глютаральдегида на фосфатном 1М буфере (рН=7,4) в холодильнике при температуре +4 °С в течение 1-го часа. Отмывку фиксатора проводили 1М фосфатным буфером (рН 7,4). Затем в течение 1-го часа в холодильнике производили дофиксацию материала 1,3% раствором тетраоксида осмия (OsO₄). Проводка по спиртам восходящей концентрации (этанол) осуществлялась по следующей схеме: 25% спирт – 5 и 10 минут; 30% спирт – 5 и 10 минут; 50% спирт – 5 и 10 минут; 70% спирт – 2 часа в холодильнике; 96% спирт – 2 раза по 25 минут; 100% спирт – 2 раза по 25 минут. Затем материал проводили через абсолютный ацетон 2 раза по 25 минут и помещали в смесь ацетон-смола (1:1) на 1 час с закрытыми пробками, затем на 1 час с открытыми пробками. Заливка материала в смолы осуществлялась с использованием равных количеств смеси А (Эпон-812 - 62мл + ДДСА - 100мл) и смеси Б (Эпон-812 - 100мл + MNA - 89мл) с добавлением ДМР-30 из расчета 0,15мл на каждые 5 мл смеси. Полимеризацию осуществляли в течение 1,5 суток в термостате при t=37°С на ночь, 45°С – на день, 54°С – на ночь. Полутонкие срезы (1 мкм) изготавливали на ультратоме «Reichert» и после окраски метиленовым синим просматривали в световом микроскопе. После этого на том же ультратоме изготавливали тонкие срезы (30 – 60 нм), которые после окраски по Рейнольдсу фотографировали и просматривали на электронном микроскопе «Jem 1010» (JEOL).

Результаты и обсуждение

Результаты гистологического исследования миокарда указывают на то, что через 12 часов после реваскуляризации конечностей отмечаются следующие нарушения периферического кровообращения: полнокровие вен и артерий, сосудов микроциркуляторного русла с расширением их просветов и истончением стенок; явления стаза и сладжа, при котором наблюдали агрегацию эритроцитов в виде "монетных столбиков". Повышенная проницаемость сосудистой стенки проявляется набуханием эндотелия, гомогенизацией отдельных сегментов и нарушением целостности стенки, а также накоплением жидкости в интерстициальной ткани с образованием периваскулярного и межуточного отека (рис. 1). Отмечаются множественные петехиальные кровоизлияния, проявляющиеся периваскулярными геморрагическими инфильтратами и локализующиеся диффузно как в субэндокардиальной и субэпикардиаьной области, так и в толще миокарда.

Наряду с микроциркуляторными нарушениями значительным изменениям подвергаются и кардиомиоциты. Мышечные волокна разобщены и имеют извитой ход, местами фрагментированы с очагами зернисто-глыбчатого распада. Отмечается белковая дистрофия кардиомиоцитов и интрацеллюлярный отек, цитоплазма их набухшая, поперечность местами отсутствует.В ядрах клеток происходит уменьшение количества хроматина, что проявляется резким разрежением центральной части кариоплазмы; лишь небольшое количество хроматина в виде глыбок гетероформы конденсируется вблизи кариолеммы.

Рис. 1. Миокард крысы при моделировании реперфузионного синдрома через 12 часов после снятия жгутов. Артериальная гиперемия, периваскулярный и интерстициальный отек миокарда (стрелки). Окраска гематоксилином и эозином. Микрофотография. Ув. 400.

Саркоплазма в таких клетках рыхлая, пониженной электронно-оптической плотности с резко расширенными канальцами цитоплазматической сети. В наибольшей степени изменениям подвергаются митохондрии, со стороны большинства из которых отмечаются набухание и увеличение в размерах, что, как правило, сопровождается нарушением правильности расположения крист, их разрыхлением, дизориентацией и дискомплексацией.

При гистолологическом исследовании тканей легких выявляются выраженные морфологические изменения с развитием признаков синдрома острого легочного повреждения. В альвеолах имеют место изменения по типу вентиляционно-циркуляторных расстройств. Они представлены более или менее обширными участками ателектаза и дистелектаза, чередующимися с участками вздутия легочной ткани. Просветы альвеол резко сужены и представляют собой узкие щели, в некоторых участках просвет альвеол не определяется. Рядом с такими зонами наблюдаются очаги резкого вздутия легочной ткани, проявляющиеся расширением просвета альвеол и истончением межальвеолярных перегородок, вплоть до их разрыва, обеднением клеточными элементами. Просветы терминальных и респираторных бронхиол резко расширены. В просветах альвеол – отечная жидкость, эритроциты, десквамированные альвеолоциты. Отек затрагивает практически все компоненты аэрогематического барьера. Так, в эндотелиоцитах капилляров межальвеолярных перегородок он проявляется в резком разрыхлении и разрежении цитоплазмы, что сопровождается снижением ее электроннооптической плотности. В цитоплазме появляются сливающиеся между собой микропиноцитозные везикулы, в результате чего образуются различные по размерам и форме вакуоли. В ядрах, имеющих, как правило, округлую и/или овальную форму, наблюдается перераспределение хроматина с его преимущественной локализацией в виде глыбок вблизи кариолеммы, из-за чего центральная часть ядра просветляется и разрыхляется. В этих условиях эндотелиальные клетки увеличиваются в размерах, что приводит к сужению просвета капилляров. Базальные эндотелиальная и эпителиальная мембраны теряют четкость своих контуров и выглядят разрыхленными, а не гомогенными. Интерстиций расширяется, само интерстициальное пространство приобретает светлый вид низкой электроннооптической плотности с разрыхленными обрывками коллагеновых волокон. Среди альвеолоцитов в наибольшей степени изменяются альвеолоциты I типа. При этом наиболее выраженные их изменения отмечаются в цитоплазматических отростках. В цитоплазме появляется большое количество хаотично расположенных микропиноцитозных везикул, многие из которых сливаются между собой с образованием более или менее крупных вакуолей. Также имеет место дегрануляция тканевых базофилов, с «запустением» секреторных гранул (рис. 2). Нарушения микроциркуляции сопровождаются развитием резкого повышения проницаемости сосудистой стенки с развитием диффузной геморрагической инфильтрацией в межальвеолярных перегородках и выраженным интерстициальным отеком.