Нарушение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможная причина изменения структуры протеогликанов в опухоли молочной железы человека (стр. 10 из 12)
А. Пациент № 58
1 - контрольная ткань
2 - контрольная ткань + хондроитиназа АС
3 - опухолевая ткань
4 - опухолевая ткань + хондроитиназа АС
5 - стандартная смесь ГАГ
В. Пациент № 54
1 - контрольная ткань
2 - опухолевая ткань
3 - контрольная ткань + хондроитиназа АС
4 - контрольная ткань + хондроитиназа АВС
5 - опухолевая ткань + хондроитиназа АС
6 - опухолевая ткань + хондроитиназа АВС
7 - стандартная смесь ГАГ
Обработка хондроитиназой АС удаляла основную массу ГАГ из препарата ПГ опухолевой ткани, что позволяет сделать вывод о появлении в опухолевой ткани хондроитинсульфатов А и С. Также после обработки проб протеогликанов опухолевой ткани хондроитиназой АС значительно уменьшалась и фракция, соответствующая по электрофоретической подвижности дерматансульфатам. Этот факт может говорить о том, что фракция дерматансульфатов в опухолевой ткани претерпевает изменения, которые, однако, не сказываются на ее электрофоретической подвижности. Возможно, в ней снижается степень модификации D-глюкуроновой кислоты в L-идуроновую.
3.6.2 Обработка препаратов протеогликанов азотистой кислотой
Для того чтобы идентифицировать присутствие гепарансульфатов, пробы ПГ обрабатывали азотистой кислотой (см. п.2.2.3.2.), результаты обработки анализировали с помощью гель-электрофореза (рис.16).
Рис.16. Препараты протеогликанов до и после обработки азотистой кислотой
А. Пациент № 51
1 - стандартная смесь ГАГ
2 - контрольная ткань
3 - контрольная ткань + HNO2
4 - опухолевая ткань
5 - опухолевая ткань + HNO2
В. Пациент № 45
1 - контрольная ткань
2 - опухолевая ткань
3 - контрольная ткань + HNO2
4 - опухолевая ткань + HNO2
5 - гепарин + HNO2
6 - стандартная смесь ГАГ
Обработка препаратов протеогликанов азотистой кислотой, избирательно разрушающей гепарансульфаты, не приводила к исчезновению нижней фракции, появляющейся в образцах ПГ, выделенных из опухолевой ткани, что позволяет дополнительно подтвердить, что она представляет собой хондроитинсульфат. После обработки азотистой кислотой препарата ПГ контрольной ткани в нем исчезала верхняя фракция, что подтверждает ее принадлежность к гепарансульфатам.
Таким образом, нами была проведена идентификация фракций протеогликанов, выделенных из контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека. Было показано, что увеличение содержания протеогликанов в опухолевой ткани происходит за счет появления в ней значительного количества хондроитинсульфатов А и С, отсутствующих в контрольной ткани.
Согласно предварительным данным, полученным после ферментативной обработки проб ПГ, в опухолевой ткани изменениям подвергается также фракция дерматансульфат протеогликанов (поскольку фермент хондроитиназа АС начинает деградировать данную фракцию).
Для проверки данного факта нами была поставлена задача, определить экспрессию декорина (как основного представителя дерматансульфат протеогликанов в тканях млекопитающих) в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека.
3.7 Определение экспрессии декорина в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека
Наличие декорина в образцах ткани определяли методом вестерн-блота (см. п.2.2.5.) с использованием моноклональных мышиных антител к коровому белку данного протеогликана.
Проявление вестерна осуществляли с помощью ECL-набора (рис.17).
Рис.17. Вестерн-блот с антителами к коровому белку декорина
1, 2 - пациент №111, контроль, опухоль
3, 4 - пациент №112, контроль, опухоль
5, 6 - пациент №117, контроль, опухоль
7, 8 - пациент №124, контроль, опухоль
Данная картина вестерна типична для протеогликанов. Хотя антителами окрашивается коровый белок, но он движется в составе единой массивной молекулы протеогликана (с углеводными цепями ГАГ). Вследствие этого четкого деления полос не происходит. Такое деление возможно лишь после удаления углеводной части протеогликана.
Согласно полученным данным, декорин присутствует как в контрольной, так и в опухолевой ткани молочной железы человека. Однако электрофоретическая подвижность декорина в опухолевой ткани значительно изменена. Это может быть обусловлено изменением структуры или количества углеводных цепей ДС, присутствующих на коровом белке декорина.
Поскольку ранее мы показали, что в опухолевой ткани молочной железы человека фракция, соответствующая по электрофоретической подвижности дерматансульфатам, деградируется ферментом хондроитиназой АС, то возможно, изменение углеводной части декорина связано с замещением ДС-цепей на ХС-цепи. Известно, что в ходе биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (и декорина, в частности) на коровом белке вначале синтезируются цепи хондроитинсульфатов, которые затем превращаются в дерматансульфаты под действием фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы.
Возможно, в опухолевой ткани происходит нарушение или потеря активности данного фермента, в результате чего на коровом белке декорина и других ДСПГ присутствуют незрелые цепи ХС.
Для изучения данного вопроса требуется определение уровня экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека.
3.8 Определение экспрессии белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека
Ранее нашей группой методами мультиплексной ПЦР и ПЦР в реальном времени было показано, что в опухолевой ткани молочной железы человека происходит снижение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с контрольной тканью и нарушение структуры мРНК-транскрипта.
Нашей задачей было определение наличия белковой молекулы эпимеразы в тех же клинических образцах.
Присутствие молекулы D-глюкуронил С5 - эпимеразы в ткани определяли методом вестерн-блота с использованием поликлональной кроличьей сыворотки. Проявление вестерна осуществляли с помощью ECL-набора (рис.18).
Рис.18. Вестерн-блот с антителами к
D-глюкуронил С5-эпимеразе
1 - маркер “Калейдоскоп”
2, 3 - пациент №111 контроль, опухоль
4, 5 - пациент №112 контроль, опухоль
6, 7 - пациент №113 контроль, опухоль
8, 9 - пациент №114 контроль, опухоль
10, 11 - пациент №117 контроль, опухоль
Нами были исследованы образцы ткани 20 пациентов, и было показано, что в опухолевой ткани молочной железы человека происходят изменения в структуре D-глюкуронил С5-эпимеразы.
У части пациентов в опухолевой ткани данный белок не детектировался, а в контрольной ткани присутствовали дополнительных укороченные фрагменты эпимеразы (100, 75, 40 кДа). У других пациентов экспрессия эпимеразы детектировалась как в контрольной, так и в опухолевой ткани, однако в опухолевой ткани также присутствовали укороченные фрагменты белка. Возможно, такие различия связаны с клиническими диагнозами пациентов.
Таким образом, в опухолевой ткани молочной железы человека происходят изменения в экспрессии белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы, что подтверждает наше предположение о возможном участии данного фермента в изменении структуры цепей ГАГ при опухолевом перерождении.
Заключение
Таким образом, в ходе проделанной работы нами был отработан метод выделения протеогликанов из микроколичеств клинического материала контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека и проведен сравнительный анализ содержания ГАГ в нормальной и опухолевой ткани. Данный анализ показал, что в опухолевой ткани молочной железы человека происходит увеличение содержания суммарных протеоглликанов в среднем в 4.3 раза, при пересчете на массу ткани, и в среднем в 2 раза, при пересчете на количество нуклеиновых кислот в ткани, по сравнению с контрольной тканью.
Был подобран оптимальный буфер для проведения электрофоретического разделения ПГ. Проведена очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот.
Была проведена идентификация фракций протеогликанов, выделенных из контрольной и опухолевой ткани молочной железы 26 пациентов. Было обнаружено, что увеличение содержания ПГ в опухолевой ткани происходит за счет появления в ней значительной фракции хондроитинсульфатов А и С, отсутствующих в контрольной ткани. Также в опухолевой ткани изменена фракция дерматансульфатов, поскольку она частично деградируется ферментом хондроитиназой АС.
Факт изменения структуры углеводных частей ДСПГ в опухолевой ткани молочной железы человека был дополнительно подтвержден после определения экспрессии декорина (как наиболее характерного представителя дерматансульфат протеогликанов в тканях млекопитающих) в клинических образцах методом вестерн-блота. Данным методом было показано, что в опухолевой ткани молочной железы человека меняется электрофореточеская подвижность декорина, что может свидетельствовать о нарушении структуры его ГАГ-цепей.
Параллельное определение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы (фермента, ответственного за созревание ДС-цепей) методом вестерн-блота в тех же образцах ткани показало, что в опухолевой ткани молочной железы человека изменена структура данного фермента, или же его экспрессия не детектируется.
Полученные данные служат подтверждением выдвинутой нами гепотезы о возможной роли D-глюкуронил С5-эпимеразы в изменении состава протеогликанов в опухолевой ткани молочной железы человека.